[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原HI2的纯化方法

权利要求书

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原HI₂的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）收集自构建表达抗原HI₂的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；

B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，MMC层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的HI2进行纯化。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤B如下：

1）高压破菌：将收集的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白HI2的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀；

3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；

4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80 pH7.0-7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱：

5）MMC层析纯化：步骤4）收集的样品，pH调至3-5，使用pH3-5的NaAC缓冲液平衡层析系统及MMC层析柱，采用pH10.5-11为Na₂CO₃缓冲液梯度洗脱；

6）凝胶过滤层析纯化：将步骤5）纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用pH7.0-7.5的10-20mM PBS平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。

3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤1）所采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，离心获取破菌上清。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤2）硫酸铵分步沉淀和步骤3）再复溶。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤4）所述的GST亲和纯化，所使用的填料为GST-Sepharose 4B或GST-Sepharose 6B或GST-Sepharose FastFlow或GST-Sepharose HP。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤4）所使用的Prescission Protease酶带有GST标签。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤5）所述的纯化方法，MMC层析的填料为Capto^TM MMC；

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤6）所述的凝胶层析柱为Superdex75或Superdex200或Superdex HR10/30。

9.如权利要求1至8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的：

1）设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码HI₂蛋白活性片段的核酸序列；

2）将步骤1）所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；

3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。