[发明专利]一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用。 

背景技术

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是一种革兰氏阴性菌，能够感染多种水产动物，包括鱼类、虾类、贝类等。鳗弧菌感染可导致弧菌病，该病是世界流行性疾病，可发生在任何季节，多年来给世界产业养殖造成了严重的经济损失。基因组序列分析表明，鳗弧菌基因组含有多个鞭毛蛋白基因，分别编码鞭毛蛋白FlaA，FlaB，FlaC，FlaD，和FlaE。研究表明，突变FlaA，FlaD和FlaE基因可降低细菌的侵染能力，而突变FlaB和FlaC对于细菌侵染没有显著影响，由此推测FlaA，FlaD和FlaE可能参与细菌毒力。目前鳗弧菌鞭毛研究主要集中于致病性，鞭毛蛋白作为疫苗的可能性研究尚未开展起来。 

发明内容

本发明目的在于提供一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗，以鳗弧菌为模板，F1/R1为引物所得PCR扩增产物与载体pET259连接，连接转化后质粒经裂解与佐剂混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗； 

所述引物为F1：5’-CCCGGGATGCCTAAGGAGATCAATATG-3’；R1：5’-CCCGGGACCCAATAGACTAAGAGCT-3’。 

所述模板为鳗弧菌C312；鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.6250，保藏日期2012年6月21日，分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

以鳗弧菌为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pET259连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α筛选质粒，而后加入裂解液纯化离心后上清液稀释后与佐剂等体积混合，即得到利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗。 

利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗的应用，：所述疫苗作为抵御鳗弧菌侵染的疫苗药物。 

本发明具有如下优点：本发明的重组鳗弧菌鞭毛蛋白作为亚单位疫苗具有高效的免疫保护效应。 

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的鞭毛蛋白电泳图（泳道2）。泳道1，分子量标准。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法： 

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。 

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）； 

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。 

实施例1 

鳗弧菌鞭毛蛋白表达载体的构建方法： 

质粒pEFB1的构建：以鳗弧菌为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增鳗弧菌鞭毛蛋白FlaB基因（该基因序列已被报道。具体参见Naka H,Dias GM,Thompson CC,Dubay C,Thompson FL,Crosa JH.Complete genome sequence of the marine fish pathogen Vibrio anguillarum harboring the pJM1 virulence plasmid and genomic comparison with other virulent strains of V.anguillarum and V.ordalii.Infect Immun2011;79:2889–900）。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA,然后94°C40s,50°C60s,72°C60s,5个循环；然后94°C40s,62°C60s,72°C60s,25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。