[发明专利]以 Wnt为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种以 Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有组成型 Wnt活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。

技术背景

 Wnt是一条进化上高度保守的信号通路，从线虫到人类，均有 Wnt家族成员存在。果蝇含有 7 种  Wnt 基因，而在脊椎动物中含有 19 种。通过小鼠体内β-catenin（CTNNB1）功能缺陷和功能获得性的试验证实，在胚胎发育早期的各个阶段， Wnt 家族成员直接决定着细胞的分化方向，同时也调节了诸如心血管、中枢神经系统、肾脏和肺等组织器官的分化发展。在成人体内， Wnt 信号通过调节干细胞的分化来维持组织自我更新。然而， Wnt 信号通路的异常活化，常常导致人类的发育缺陷、癌症及各种疾病。

1993 年，Vogelstein报道了肿瘤抑制因子APC可以与 Wnt通路核心成员β-catenin相互作用，肿瘤与 Wnt信号通路之间的关联才逐渐为人们所知。在过去19年的研究中，人们发现  Wnt信号通路是多种恶性肿瘤发生的共同途径。在诸如结肠癌、黑色素瘤、毛母质瘤、肝癌、成神经管细胞瘤、肝母细胞瘤、胃肠癌、韦氏肿瘤等超过 3500多种不同癌症中，病变组织中均能检测到 CTNNB1的突变或  Wnt 信号通路的异常活化。统计发现，超过有超过700个病例的 CTNNB1突变发生在β-catenin的N端，这些突变或者改变了β-catenin 磷酸化的位点Ser45、Thr41、Ser37 和 Ser33，或者改变了与这些位点相邻的其他氨基酸。 Wnt 信号通路相关基因 APC，AXIN1，AXIN2 和 CTNNB1 的突变直接导致了细胞质内β-catenin的积累，过剩的β-catenin入核转录 Wnt下游基因，导致组织细胞恶性增殖，引发癌症。 在绝大部分结肠癌和消化系统癌症中，都能检测到APC、AXIN 或者 CTNNB1基因的突变。在结肠癌  Wnt 信号通路异常活化的病例中，将近 80%是由 APC 基因的突变或缺失造成的。在肝癌的病例中，良性肝细胞腺瘤中若出现  Wnt信号通路的异常，将大大增加其转变为恶性肝癌的风险。不同于结肠癌的是，恶性肝癌中 APC 突变发生的概率很低，而 CTNNB1和 AXIN1基因的突变更为常见。这些突变阻断了β-catenin 被磷酸化及泛素化修饰的途径，打破了体内的动态平衡，使β-catenin得以积累并入核，最终导致细胞的恶性增殖或分化。

基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的Wnt抑制剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者；然而时至今日理想的产品少之又少，很大程度缘于没有一套高效而简易的筛选方法；基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激（先用激活剂激活Wnt，再去筛选抑制剂），这样不仅步骤多，而且筛选成本也较高，尤其是像细胞因子Wnt3                                                等激活剂的使用将大大增高成本；即使像Licl类激活剂使用成本较低，但由于其本身毒性较大，限制了其使用；同时筛选体系每增加一步，会使报告系统的不稳定性增加（额外的操作必然会带来额外的不确定因素）。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种以 Wnt为靶点的药物筛选细胞模型。

本发明的另一目的是提供一种以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。

本发明还有一个目的，就是提供以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用。

（一）以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型药物筛选细胞模型

本发明以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有β-catenin特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型Wnt的活性细胞为基础，构建成稳定的以Wnt信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。

 所述β-catenin的特异性结合序列为 5’-AGATCAAAGGG-3’。

所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。

所述具有组成型Wnt活性细胞为一类具有持续活化Wnt活性的细胞，主要有DLD1前列腺癌细胞、Hep3B人肝癌细胞、HCT116人结肠癌细胞等。