[发明专利]以 Wnt为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用

权利要求书

1.以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：利用含有β-catenin特异性结合序列的报告系统载体，以具有组成型Wnt的活性细胞为基础，构建成稳定的以Wnt信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。

2.如权利要求1所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：所述β-catenin的特异性结合序列为 5’-AGATCAAAGGG-3’。

3.如权利要求1所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin 特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。

4.如权利要求1所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型，其特征在于：所述具有组成型Wnt的活性细胞为DLD1前列腺癌细胞、Hep3B人肝癌细胞、HCT116人结肠癌细胞。

5.如权利要求1所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下工艺步骤：

（1）报告系统载体构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有β-catenin特异性结合序列以及3’端含有 TATA 盒序列的 DNA 片段，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体；

（2）细胞模型的构建：将所述报告系统载体转染具有组成型Wnt的活性细胞后，用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，选取对Wnt信号抑制剂有响应的克隆，即为以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型。

6.如权利要求1所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由Wnt组成型活化造成的肿瘤治疗药物。

7.如权利要求6所述以Wnt为靶点的药物筛选细胞模型用于筛选由Wnt组成型活化造成的肿瘤抑制药物，其特征在于：所述药物筛选的方法如下：

(1) 将所述药物筛选细胞模型用100                                               l培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为50%~60%；

(2) 培养基中加入待筛选化合物0.1 l~2l，继续培养24 小时；

(3) 在上述96孔板中加入50 l稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光抑制率，当荧光抑制率达到40%以上得到初筛产物；

(4) 以化合物细胞毒性实验消除初筛产物对细胞模型的直接损伤，荧光抑制率仍在40%以上得到复筛产物，即为以Wnt为靶点的肿瘤抑制药物。