[发明专利]靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法

说明书

技术领域

本发明设计一种抗猪蓝耳病病毒转基因细胞系的构建；具体地讲，本发明设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的Marc-145细胞克隆。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症于上世纪80年代末首次在美国发现，其致病病原为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRS virus，PRRSV)，主要造成母猪繁殖障碍和大量仔猪死亡，仔猪发病率100%，死亡率50%以上，母猪流产率达30%以上，是一种重要的动物疫病。 

近年猪蓝耳病在我国大面积暴发，防治高致病性蓝耳病的根本有效措施主要依靠疫苗，但成本高、手续烦琐，而且价格非常昂贵，极大的增加了养殖成本，增加了猪农的负担，应用范围受到极大限制。 

猪蓝耳病（PRRS）是严重危害养猪业的病毒性传染病，死亡率极高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。虽然国内外对PRRS的疫苗研究非常活跃，但到目前为止，仍没有一种疫苗可对猪体产生完全安全的保护，普遍存在难以诱发较早和较高的抗体水平等问题。 

Marc-145细胞来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞是目前对PRRSV最敏感的细胞系之一。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种靶向基因shRNA干扰猪生殖与呼吸综合症病毒增殖和复制的转基因细胞系的构建方法及相应的重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，为开辟控制猪PRRS感染和减少其危害提供技术支持。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，包括以下步骤： 

1）、设计靶向基因shRNA： 

ORF6-6e： 

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3' 

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'； 

2）、构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA： 

通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e 所述的shRNA酶切（EcoRI-BamHI 

）连接到pMD18-T Simple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上， 构建了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA。 

本发明还同时提供了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法：设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA（即，ORF6-6e），并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。 

作为本发明的转基因细胞系的构建方法的改进，利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤： 

将重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA用lipofectin2000(Invitrogen)转染试剂转染Marc-145细胞； 

到细胞增长接近汇合时按1：10密度（即细胞密度稀释10倍）传代，继续培养；培养基为含有10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培养基；即，该培养基的制备方法为：在每升DMEM（Gibco）基本培养基中加入100ml的胎牛血清； 

待细胞密度增至50％～70％汇合时，加入G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基，每3-5天更换一次G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基；当有大量细胞死亡（即超过80%的细胞死亡）时，改用G418浓度为600μg/ml的筛选培养基维持筛选（即，将G418浓度减半进行筛选）；每3-5天更换一次G418浓度为600μg/ml的筛选培养基；筛选10～14天后，有抗性的克隆细胞出现，改用含有10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培养基进行培养（即停药培养），待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系；