[发明专利]一种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体而言，涉及一种紫珠属植物新鲜叶片和硅胶干燥叶片的DNA提取方法。

背景技术

马鞭草科紫珠属植物共有150余种，中国产49种，其中大多数种类叶片和根中富含黄酮类、缩合鞣质、多糖类等次生代谢物质，具有止血、散瘀、消炎等功效，因此本属许多种植物是我国传统的中药材。此外，本属植物因果实紫色似串串珍珠而得名，是优良的秋冬季观果园林植物，极具观赏价值和开发前景，但有些种类存在株型散乱、果实小、抗性差等问题，因此，为了改良上述不良性状，开发本属植物的园林观赏价值，有必要开展紫珠属植物的育种研究，从而获得园林性状更加优良的资源。

随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助育种技术可大大加快育种进程，提高育种效率。而DNA提取是开展分子标记研究的前提和关键。紫珠属植物作为药用植物，其叶片和根部都含有较多的黄酮类、缩合鞣质，这些次生代谢物的存在严重影响了DNA 提取的纯度，进而影响到后续的DNA扩增工作。因此，紫珠属植物的DNA成功提取是开展本属植物分子标记和辅助育种研究的重要前提。关于紫珠属植物叶片DNA提取方法未见报道。     

电泳结果表明，传统的DNA提取方法（如SDS法）提取出来的本属植物老鸦糊、紫珠、枇杷叶紫珠等种类的叶片DNA中常含有蛋白质，在紫外灯下表现为点样孔呈现亮带，DNA纯度检测显示A_260/280 小于1.80，且由于叶片中含有较多的黄酮类、缩合鞣质等杂质，这些物质的存在对后续的分子标记技术有很大的影响。因此，有必要对紫珠属植物的叶片DNA提取方法进行改进。

发明内容

针对上述情况，为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于通过大量试验研究，提供一种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法。该方法可有效解决传统SDS提取法提取的总DNA带有少量蛋白，并消除紫珠属植物叶片内过多的黄酮类、缩合鞣质等杂质造成的DNA纯度低的问题。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，包括如下步骤：

（1）在灭菌离心管中加入裂解液，备用，所述裂解液包含如下组分：pH8.0的Tris·HCl 80-120mM、pH8.0的EDTA 30-60mM、NaCl 60-120mM、3-6wt% PVP、1.5-2wt% SDS、2-3wt% 巯基乙醇、0.7-1.2wt% RNAase；

（2）取紫珠属植物的叶片，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，然后将粉末转入所述离心管中，使样品与裂解液充分混匀；

（3）将上述离心管置于62-68℃水浴中保温15-30min，期间轻轻摇动离心管2-4次；

（4）取出离心管，加入KAc使终浓度为0.8-1.2M，然后冰浴15-30min；

（5）室温下10000-15000rpm离心；

（6）取上清液置另一灭菌离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇混合溶液，其配比是氯仿：异戊醇体积比为24：1，混匀，室温下6000-10000rpm离心；

    （7）取上清液置于新的灭菌离心管中，重复步骤（6）操作；

    （8）离心后取上清液转入新的灭菌离心管中，加入2/3体积的-20℃下预冷的异丙醇，混匀，置于-20℃冰箱中20-40min；    

    （9）取出后6-12℃下10000-15000rpm离心,弃上清液，收集沉淀；

（10）加入70%（v/v）乙醇漂洗沉淀，然后6-12℃下13000-18000rpm离心，弃上清，收集沉淀；

（11）重复步骤（10）操作；

（12）弃上清，得基因组DNA。

优选地，所述用于提取紫珠属植物叶片DNA的方法，包括如下步骤：

    （1）在灭菌离心管中加入裂解液，备用，所述裂解液包含如下组分：pH8.0的Tris·HCl 90-110mM、pH8.0的EDTA 45-50mM、NaCl 90-100mM、4-5wt% PVP、1.5-2wt% SDS、2.3-2.7wt% 巯基乙醇、0.9-1.1wt% RNAase；

    （2）取紫珠属植物的叶片，在研钵中加液氮迅速研磨呈粉末，然后将粉末转入所述灭菌离心管中，上下颠倒，使样品与裂解液充分混匀；

    （3）将上述离心管置于65℃水浴中保温20min，期间轻轻摇动离心管2-3次；