[发明专利]用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法

权利要求书

1.一种用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：包括下列步骤：

a．确定用多波长吸收单通道同步测定多种酶活性所需显色底物组合：

a1根据待测酶的专一性筛选满足下列条件的显色底物组合：所选显色团能分别用于制备待测酶的显色底物；所得这些显色底物组合中，将显色底物在对应待测酶作用下所得显色产物相对该显色底物的差吸收峰最大波长从大到小排列，相邻的显色产物差吸收峰最大波长之间相距大于30nm且尽量远；在按显色产物差吸收峰最大波长从大到小的排列中，除了显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物外，每个显色底物在对应酶作用下所得显色产物差吸收峰最大波长，都与此排列中某个显色底物的最大等吸收波长相差小于25nm且尽量短；

a2用步骤a1所选显色团分别合成待测酶的对应显色底物并组合使用；

b．在一个反应混合物或酶反应体系即单反应通道中，同步启动多个待测酶针对组合使用的显色底物混合物对应显色底物的专一催化反应；

c.选择测量波长组合：以显色产物差吸收峰最靠近红外端的显色底物为显色底物A，在显色底物A的显色产物差吸收峰最大波长下测定该显色产物吸收；在显色底物A的等吸收波长处测定其余待测酶显色产物或显色底物的吸收；

d．在所选多个测量波长组合下，通过快速变换测量波长，多波长吸收同步测量实现同步跟踪单通道中多个待测酶的反应过程；

e.基于无相互作用物质吸收的线性加和性建立消除反应通道中显色物质吸收重叠干扰的数据处理方法，获得消除吸收光谱重叠干扰后每个待测酶的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰且其底物浓度在对应酶米氏常数的3倍以上，用经典初速度法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；如某个待测酶不受反应体系其它酶的产物及底物的干扰但所用显色底物浓度在该酶米氏常数的5％以上而低于米氏常数的3倍，联用经典初速度法和反应过程分析法分析其显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线确定初速度；当某个待测酶受反应体系中其自身和/或其它酶的底物和/或产物的干扰时，将描述反应体系动力学的微分速度方程组数值积分后分析活性受到干扰待测酶反应的显色产物或显色底物无干扰吸收变化曲线，确定其最大反应速度表示其活性，或据其微分速度方程和所得最大反应速度换算成底物浓度为起始底物浓度93％时初速度表示该待测酶的活性。

2.根据权利要求1所述用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：显色产物相对显色底物差吸收峰最大波长在300nm以上且其显色底物吸收峰最大波长小于其对应显色产物吸收峰最大波长，否则测定该酶催化逆反应的速度表示该酶的活性；显色产 物差吸收峰最大波长相邻的任两个显色底物中，显色产物差吸收峰最大波长更靠近红外端显色底物的最大等吸收波长与显色产物差吸收峰最大波长更靠近紫外端显色产物的差吸收峰最大波长相等或相距不超过5nm为优化的显色底物组合；所用显色底物组合中每个显色底物都仅被样品中的一种待测酶作用生成对应显色产物，而不被样品中其它任何酶作用或作用效果不明显；步骤b中，选择适于同步测定活性的待测酶发挥作用的缓冲介质和反应条件，即缓冲介质pH位于pH 5.0到9.0之间且接近比活性最低待测样品的最适pH，所用反应温度在摄氏20到40度之间。

3.根据权利要求2所述的用多波长吸收单通道同步测量多种酶活性的方法，其特征在于：所述显色底物包括天然显色底物和非天然显色底物；天然显色底物包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；非天然显色底物由显色团和被酶识别基团组成，显色团包括但不限于4-硝基苯酚、4-硝基苯硫酚、4-硝基苯胺、4-硝基-1-萘酚、4-硝基-1-萘硫酚、4-硝基-1-萘胺、2-萘酚、4-氯苯酚、玫红酸或这些芳香酚及芳香胺的衍生物。