[发明专利]负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种长效安全的抗菌纳米材料的制备方法，具体涉及一种负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，属于医药工程技术领域。 

（二）背景技术

抗菌肽又称抗微生物肽或肽抗生素，在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分。抗菌肽不仅有广谱抗菌能力，而且对真菌、病毒及癌细胞也有作用。近年来，由于药物的滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日渐严重，从而引发了人们对食品和环境的关注，越来越多的国家开始呼吁禁止滥用抗生素。而抗菌肽因其独特的生物活性，以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起了人们极大的研究兴趣，成为分子生物学和生物医学研究领域的热点之一。 

天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约在1.8~4.0kDa之间。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100℃下加热10~15min仍能够保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。研究表明，抗菌肽分子通过膜内分子间的位移而相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，使膜蛋白凝集，使细菌不能保持正常的渗透压而死亡。也有科学家认为是通过影响细胞膜上的能量运转和代谢，从而损伤细胞呼吸链的功能而杀死细菌。总之，抗菌肽的作用机理的关键在于通过物理方式和细胞壁发生作用而产生的抗菌活性。抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核细胞不起作用。原因在于原核生物和正常真核生物的细胞膜结构不同，正常真核生物细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此外，高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，其存在也抵抗了抗菌肽的作用。因此，抗菌肽天然就存在靶向性，其能够靶向抗菌，而不会破坏正常高等动物细胞。 

但是，抗菌肽被广泛应用的障碍是天然资源有限，而化学合成和基因工程等合成技术还不够成熟，合成抗菌肽成本较高，所以目前在实际应用过程中，就需要一种高效的负载方式，来包埋抗菌肽。 

高聚物纳米材料作为药物载体已经获得广泛研究。对于亲水性抗菌肽的包埋，可以选择利用壳聚糖和γ-聚谷氨酸(γ-PGA)作为载体材料，通过壳聚糖和γ-聚谷氨酸之间离子交联，制备纳米载体。这种纳米载体的优点是不使用有毒溶剂，制备条件较缓和。这可以避免有机溶剂的存在使抗菌肽不稳定，而发生降解。 

目前，壳聚糖与γ-聚谷氨酸通过离子交联法制备纳米粒子的研究并不很多，现有的相关研究并没有获得既能够大大降低突释率，又能够获得缓慢药物释放的高效的药物包埋纳米体系。 

（三）发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，制得的负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子能减少抗菌肽的初期突释，有效延长药物的释放时间，达到高效使用抗菌肽的目的。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案： 

一种负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，是以质量比为50：10~50：1~50的壳聚糖、γ-聚谷氨酸和抗菌肽为原料，首先是通过γ-聚谷氨酸与抗菌肽之间的离子交联作用制备成γ-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子，然后再利用壳聚糖与γ-聚谷氨酸之间存在离子交联作用，对制备的γ-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子进行再包裹，得到负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子；具体包括如下步骤： 

（1）将0.5~5.0mg/mL的γ-聚谷氨酸水溶液与0.01~10.0mg/mL的抗菌肽水溶液混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到γ-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液； 

（2）取步骤（1）得到的γ-聚谷氨酸/抗菌肽复合纳米粒子溶液滴于壳聚糖醋酸水溶液中， 所述壳聚糖醋酸水溶液中壳聚糖浓度为0.5~5.0mg/ml，醋酸体积浓度为1~3%，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，不会出现沉淀和絮凝现象，然后离心，取沉淀冷冻干燥，即得负载抗菌肽的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子。 

本发明中，所述的壳聚糖的脱乙酰度为85%～95%，分子量15～150万。在本发明中，壳聚糖的脱乙酰度和分子量对于纳米粒子的性能影响不大。 

本发明中，所述的γ-聚谷氨酸纯度在92.0%与99%之间，分子量100~145万。 

本发明中，所述的抗菌肽等电点大于7，可以是各类哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、昆虫动物抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽和病毒抗菌肽，本发明中主要以人源抗菌肽LL-37为例进行说明。