[发明专利]挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法。

背景技术

随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究更显重要，而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域。（郭晓强，郭争亮．真核生物转录机理的结构基础．生物学通报，2006，41(11)：60-61）细胞基因的表达，即由DNA转录成RNA再翻译成蛋白质的过程，是受到严格的调节控制的。在细胞的生长、发育和分化过程中，遗传信息的表达可按一定时间程序发生变化，而且随着细胞内外环境条件的改变而加以调整，这就是时序调控和适应调控。其中，转录水平的调控是关键的环节，因为遗传信息的表达首先涉及到的是转录过程。

转录调控主要发生在起始和终止阶段。启动子是转录起始的控制部位，它是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为转录因子，它的作用或是识别DNA的顺式作用位点，或是识别其他因子，或是识别RNA聚合酶。

实际上，基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式，涉及基因组DNA和一系列结合蛋白的相互作用。不同生理条件下特异性的基因转录调控依赖于不同的反式作用因子与顺式作用元件的特异性结合。因此，深入研究基因表达调控的分子机制，必须要研究DNA-蛋白质的相互作用，即需要明确哪些转录因子与哪些基因的转录调控区域发生了特异性结合。（BrivanlouA H，Damell J E Jr．Signaltransduction and the control of gene expression．Science，2002，295(5556)：813-818）建立有效的研究方法可以大大促进该领域的研究。

蛋白分子与启动子DNA的结合具有特异性，这是研究启动子DNA结合蛋白的前提。目前研究DNA与蛋白相互作用的常见方法有DNaseI足纹法(DNaseI footpriting)、酵母单杂交系统(Yeast One-Hybrid System)、凝胶阻滞试验(gel retardation assay)等。但上述方法都有一定的局限性。DNaseI法只是针对某一特定蛋白与核酸互作，或是某一特定短核酸序列与蛋白互作的研究，因此获得的只是某个单一的核酸片段或单一的蛋白；而酵母单杂交系统同样是研究细胞内蛋白质与DNA的特定序列间的相互作用，但一次只能研究特定基因的一个启动因子；而凝胶阻滞试验则是一种定性研究蛋白与基因互作的方法，但无法确定具体的蛋白。

因此，亟待开发出新的工具和技术手段来研究DNA与蛋白的相互作用。从而从转录水平上研究基因表达的调节，寻找新的蛋白并了解其对转录调节的作用，为阐明某些疾病的发病机制及基因治疗奠定了基础。

发明内容

本发明旨在针对现有研究DNA与蛋白相互作用的方法中存在的不足，提供一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法，包括以下步骤：

1）将5’或3’端带有生物素的启动子序列或其片段与表面吸附有链亲和素的磁珠结合，形成磁珠-启动子二元复合物；

2）分别从处于不同生长、发育或分化阶段的细胞或组织中提取核蛋白，然后分别将这些特定时期的核蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合，从而形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物；

3）对步骤2）中得到的三元复合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，找出差异条带，以确定所要候选目的蛋白的片段长度，然后进行二维电泳分离提纯目的蛋白，并对纯化的目的蛋白进行质谱分析或氨基酸测序，从而确定所含蛋白。

优选地，所述步骤2）为：分别从处于不同生长、发育或分化阶段的细胞或组织中提取核蛋白，并分别将这些特定时期的核蛋白与能够竞争性封闭所述启动子序列或其片段上非特异性蛋白结合位点的蛋白混合，然后分别将这些混合好的蛋白与磁珠-启动子二元复合物结合，从而形成磁珠-启动子-核蛋白三元复合物。其中，能够封闭所述启动子序列或其片段上非特异性蛋白结合位点的蛋白为BSA蛋白或脱脂奶粉。此外聚核苷酸竞争物、鲑精DNA等也可以提高杂交的特异性。

本发明是基于DNA-蛋白质相互作用的原理，结合生物素-链亲和素系统、磁珠分离技术开发出一种挖掘真核生物基因转录调控组差异蛋白的方法。