[发明专利]人体外周血诱导免疫抑制性B淋巴细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种人抑制性B淋巴细胞的诱导培养、纯化以及潜在的细胞疗法在自身免疫性疾病中的应用。

背景技术

近年来，某些小鼠的B细胞亚群能分泌调节性的细胞因子以及具有免疫抑制效应的细胞称为调节性B细胞。在小鼠的各种疾病模型中，尤其是自身免疫性疾病的小鼠模型中，研究者已经发现调节性B细胞的存在及其和疾病的发生、发展有一定的关联。到目前为止，已经发现具有调节功能的B细胞包括B1a,T2-MZ前体细胞，B10细胞(CD19^hiCD1d^hiCD5⁺)等。虽然它们的表型不同，但是这些B细胞都能分泌IL-10和/或TGF-β。我们最近的研究发现BAFF能够体外诱导调节性B10细胞的产生，而且将调节性B10细胞输入到自身免疫性关节炎以及I型糖尿病的小鼠模型中，能够有效地抑制疾病的发生和发展。基于这些临床前试验的结果，我们提出是不是在人体也存在调节性B细胞的可能。事实上，人调节性B细胞的存在已经被证实，据报道虽然人调节性B细胞在自身免疫性关节炎病人的外周血中的比例较正常人没有很大改变，但是它们的抑制功能却明显降低。已经报道的人调节性B细胞的亚群包括过度性B细胞(CD19^hiCD24^hiCD38^hi)和记忆性B细胞(CD19^hiCD24^hiCD27⁺)。但大量获得具有免疫抑制功能的B细胞的方法还存在困难。基于报道和实验基础，我们提出BAFF可以诱导人抑制性B细胞的产生，并对这种抑制性B淋巴细胞的表型和功能特征进行鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效诱导及纯化抑制性B淋巴细胞的方法，为临床细胞疗法在自身免疫性疾病的应用提供平台。

本发明所述的人重组BAFF细胞因子诱导抑制性B淋巴细胞产生的方法，其步骤为：

（1）从新鲜的人外周血中分离人外周血单个核细胞，然后置于含10%FBS的RPMI1640培养液培养;

（2）在第1，3，5天，加入50ng/ml人重组BAFF细胞因子诱导抑制性B淋巴细胞的产生。

上述方法中，步骤（1）中将人外周血单个核细胞浓度调整为5×10⁶/ml,培养体系：1ml。

本发明方法中，人外周血淋巴细胞在重组蛋白BAFF的诱导下产生抑制性B淋巴细胞；产生的抑制性B淋巴细胞经功能鉴定，表明BAFF诱导的B淋巴细胞对T淋巴细胞体外增殖具有抑制效果。

附图说明

图1：抑制性Ｂ淋巴细胞的表型鉴定

A，人外周血单个核细胞在BAFF的刺激下在体外诱导培养7天，用流式细胞技术检测BAFF诱导的Ｂ淋巴细胞分泌IL-10的能力。如图所示，百分比代表IL-10⁺B细胞占所有B细胞的比例；

B，所表达的GITR和CD5以及IL-10B细胞所表达的GITR和CD5,百分比代表82%的IL-10⁺B细胞是GITR和CD5双阳性。

图2：抑制性B淋巴细胞的功能鉴定

A，磁珠纯化分选的CD4⁺T细胞，用CFSE标记，然后用抗CD3和抗CD28诱导增殖，在培养体系中加入新鲜分离的B细胞，BAFF诱导的Ｂ细胞以及BAFF诱导并且分选纯化的GITR⁺CD5⁺的双阳性Ｂ细胞共同培养3天。百分比代表Ｔ细胞的增殖情况（*,p<0.05;#,p<0.01）。

具体实施方式