[发明专利]一种高效制备重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及到一种重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的制备方法，同时涉及提高rh-bFGF在大肠杆菌中表达量的方法。 

发明背景 

重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor，rh-bFGF)是成纤维细胞生长因子(bFGF)家族的一个重要成员，目前所确定的bFGF分子量有18kD、22kD、22.5kD、24kD和34kD五种形式(Florkiewicz RZ，Sommer A.Human basic fibroblast growth factor gene encodes four polypeptides，three initiate translation from non-AUGcodons.Proc Natl Acad Sci USA，1989Jun，86(11)：3978-3981；Arnaud E，Touriol C，Boutonnet C，Gensac MC，Vagner S，Prats H，Prats AC.A new 34-kilodalton isoform of human fibroblast growth factor 2is cap dependently synthesized by using a non-AUG start codon and behaves as a survival factor.Mol Cell Biol，1999Jan，19(1)：505-514)，其中分子量为18kD的bFGF包含155个氨基酸，不含N-端原子定位信号，且为bFGF活性的主要形式(Patry V，Bugler B，Amalric F，ProméJC，Prats H.Purification and characterization of the 210-amino acid recombinant basic fibroblast growth factor form(FGF-2).FEBS Lett，1994Jul 25，349(1)：23-28)。 

从不同组织提取的bFGF肽链长短不一，分子量均少于18KD。如牛脑垂体bFGF是由146个氨基酸组成的单链非糖化多肽，分子量为16.4KD。这是由于不同的bFGF的分子量因其N末端不同而异，bFGF羧基末端较氨基末端稳定，少于155个氨基酸的bFGF均为其氨基末端截取形式。现已证实含155个氨基酸的bFGF其氨基末端截取少于25个氨基酸时并不影响其生物学活性。(Chen-xiao Jia et al，Cloning and high level nonfusion expression of recombinant human basic fibroblast growth factor in Escherichia coli.Acta Pharmacol Sin，2002sep；23(9)：782-786)。 

bFGF在生物进化上具有很强的保守性，如：人bFGF(h-bFGF)和牛bFGF氨基酸顺序同源性达98.7％，鸟类和牛bFGF完全相同。 

rh-bFGF具有重要的临床应用价值，是基因工程重组蛋白质类药物，是治疗人体烧伤、组织创伤、手术伤及难治性溃疡(如褥疮、糖尿病导致的肤体溃疡伴有末梢神经炎等)等疾病的首选药物，是药效明确、市场认可度高的品种之一。同时rh-bFGF在治疗脑中风后遗症、脑呆、退行性神经病变、缺血性心脏病和外周血管病等方面有多项进入临床试验(牟旭鹏， 人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达，吉林大学，2006，5；CHEN Qiong-yu et al.，High and stable expression of an analog of human basic fibroblast growth factor in Escherichia coli.Chinese Journal of Pathophysiology 2006，22(2)：247-250)。 

bFGF来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等，但由于其含量极少，因此难以从纯天然的组织中获得。通过基因工程的手段在大肠杆菌中发酵不失为一种理想和常用的方法。