[发明专利]用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及对血液保存或血液代用品中高铁血红蛋白(MetHb)含量的测定方法，特别是涉及一种用拉曼光谱法测定高铁血红蛋白(MetHb)含量的方法。

背景技术

目前，供血短缺的情况日益凸显，血液代用品的研发势在必行，高铁血红蛋白（MetHb）含量这一指标在血液代用品质量控制中必不可少。其中,基于血红蛋白的氧载体（HBOCs）是目前研究较多的一类血液代用品，美国FDA已将高铁血红蛋白（MetHb）含量作为HBOCs产品必检指标。现有对血液或血液代用品中MetHb含量的测定方法主要都是利用可见光或紫外光光源产生的光谱测定，主要有氰化物法、计算分光光度法和等吸收点法（阚雪梅，et al.，高铁血红蛋白含量测定方法研究进展.军事医学科学院院刊，(04):p.385-388.）。血液代用品制备过程中会涉及到血红蛋白的改构，改构的血红蛋白光学性质改变，并且其粒径小于可见光波长，测量时引起光散射，导致测量结果不准确。

以上方法用于血液代用品质控时分别存在以下缺陷：

氰化物法测定原理是利用弱酸性条件下加入氰化物与MetHb结合形成MetHb·CN，从而使MetHb的特征吸收峰消失。加入氰化物前后吸收值的变化与MetHb的含量成正比。本测定方法基于吸收值的变化，除MetHb外其他成分在加入氰化物前后吸收值不发生变化，方法准确度不受溶液中其他成分的影响。氰化物法适用于几乎所有红细胞和无基质血红蛋白样品（血红蛋白溶液），不受种属差异的限制。对于HbV（微囊包裹的血红蛋白）等容易引起光散射或膜难以破坏不能完全释放血红蛋白的样品，不能使用以血红蛋白光学吸收特性为基础的测定方法，包括氰化物法。氰化物遇酸或紫外线照射可产生剧毒的HCN气体，试剂保存时间短，所以，氰化物法不适合HBOCs（血红蛋白氧载体）的在线检测。

计算分光光度法是利用物质在一定波长处吸收值与浓度之间呈线性关系及多组分物质在某波长处吸收值等于各组分吸收值之和建立的。利用分光光度计直接测定样品在多个波长处的吸收值来计算MetHb含量，主要有三波长法、四波长法和连续波谱法。计算分光光度法原理多被各种血气分析仪采用。计算分光光度法易受血红蛋白种属来源和溶液pH影响。它是将红细胞溶血后释放血红蛋白，测定样品在某些波长处的吸收值，操作简单、快速、安全，但是计算公式推导过程相对复杂。在推算MetHb含量计算公式时需要特定条件下各成分的消光系数ε，对于文献中无法查到的ε需要实验计算，相对麻烦。

等吸收点法是相同浓度的两种物质在某波长处的吸收值相同，该波长称为这两种物质的等吸收点。如文献（高铁血红蛋白简易测定法，刘兰廷，黄如衡，军事医学科学院院刊，1986年第10卷第3期，229-233）报导，使用兔血进行实验得到，相同浓度的O₂Hb(氧和血红蛋白)和MetHb吸收曲线在某波长处相交，即两者的消光系数相同，当样品总浓度相同，O₂Hb与MetHb比例不同，在该波长处的吸收值仍相同。等吸收点法是利用等吸收点和郎伯比尔定律得到MetHb含量的计算公式：

MetHb%=Ex-rEE(R-r)]]>

式中，Ex、E分别为635nm与590nm的吸光度；R为100％高铁血红蛋白在635nm和590nm吸光度的比例常数，r为100％血红蛋白在635nm和590nm吸光度的比例常数。等吸收点法r值误差较大，制备100％血红蛋白溶液是利用中性NaCN与MetHb作用形成MetHb·CN，消除MetHb在635nm处最大吸收峰原理，但是MetHb·CN存在干扰，使r值误差较大，590nm处Hb和低浓度MetHb吸收曲线较陡，各种误差因素对590nm处的光密度值影响较大。