[发明专利]用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法

权利要求书

1.用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法，包括以下步骤：

1）针对待测样品的种类制备不同高铁血红蛋白含量的标准溶液：将质量浓度为10％的K₃Fe(CN)₆溶液以不同体积分别与待测样品混合，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液，用已知的检测方法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb%；

2）用显微共焦拉曼光谱仪对上述含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液进行检测，测定范围在1200-1300cm^-1之间，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的拉曼光谱；并对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑；

3）确定拉曼光谱法的测定公式：按算式计算含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的PR值,其中I₁₂₁₅为拉曼光谱在拉曼频率为1215cm^-1处的峰强度值，I₁₂₂₇为拉曼光谱在拉曼频率为1227cm^-1处的峰强度值；依据PR值与步骤1）定值的MetHb%值确定线性关系式PR=k1·MetHb%+a，k1为斜率,a为截距，再反推确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式；

4)按步骤2）的操作测定待测样品的拉曼光谱，并按步骤3）的操作得到待测样品的PR值，代入步骤3）确定的拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式，得到待测样品的MetHb%结果。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测样品为无基质血红蛋白、血液代用品或血液，待测样品形式为液体原样或袋装样品，所述种类为动物或人；步骤3）线性关系PR=k1·MetHb%+a中的k1和a的数值需要通过测定相应种类已知高铁血红蛋白含量的样品确定。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述步骤2）中用origin8.0软件对拉曼光谱进行基线校准和曲线顺滑。

4.根据权利要求1或2或3所述方法，其特征在于，所述步骤1）中所述已知的检测方法包括氰化物法、计算分光光度法、血气分析法和等吸收点法。

5.根据权利要求1或2或3所述方法，其特征在于，针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定，所述步骤1）用等吸收点法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb%；所述等吸收点法包括：在比色皿中加入50μl不同高铁血红蛋白含量的溶液和3mL缓冲液1/60M pH6.6PBS，用紫外/可见分光光度计测量A590和A630的吸光度，代入MetHb含量的计算公式：

式中，Ex、E分别为630nm与590nm的吸光度；R为100％高铁血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为1.27±0.01，r为100％血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为0.05±0.01，定值得到高铁血红蛋白的标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤3）确定的线性关系式为

PR=0.427MetHb%+17.2，确定的PR-MetHb%推导算式为

MetHb%=(0.0233PR-0.397)×100%。