[发明专利]肝素酶I的固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肝素酶I的固定化方法，尤其涉及一种以壳聚糖为固定化材料对肝素酶I进行固定化的方法，实现肝素酶I的高固定化效率，高稳定性和可重复利用性。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又发现在一些微生物和动物组织中也有肝素酶存在。肝素酶具有清除血液中残存肝素、防止凝血等功能，同时对生产低分子肝素、研究肝素的结构有重要的作用。然而游离的肝素酶容易失活，尤其是肝素酶I溶液在保存96h后活性只有原来的23%，此外，游离的肝素酶在发生反应时需要将其加入底物中，反应以后酶溶液、底物和产物混合在一起不容易分离，导致肝素酶无法重复使用，酶的利用效率低下，这为肝素酶的应用带来很多不便，因此，需要寻找一种既能提高肝素酶的利用效率，又能延长酶的保存时间的方法。

与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等一系列优点，因此，对肝素酶I的固定化是一种提高使用效果的理想选择。目前对肝素酶I进行固定化的研究较少，Howard Bernstein等[Bernstein, H. , (1987), Appl. Biochem. Biotech. 16, 129-143]以CNBr-activated Sepharose 4B为固定化材料，对肝素酶I进行了共价交联法的固定化，实现了肝素酶的固定，但是该方法的固定化效率低，我们采用相同的材料和方法得到的结果只能达到每毫升材料固定1IU的肝素酶I，而且以CNBr-activated Sepharose 4B为固定化材料成本较高。

经过长期研究，本发明的发明人发现了一种高效并且低成本的肝素酶I的固定化方法。籍此，本发明给出了一种以壳聚糖微球为材料对肝素酶I固定化的方法，固定化效率较其他方法有显著提高，且与CNBr-activated Sepharose 4B等材料相比，壳聚糖更加廉价，成本更低，同时该方法也成功实现了肝素酶I与底物和产物的分离，固定化以后的酶贮存稳定性更强，应用潜力更大。

发明内容

本发明提供了一种用壳聚糖微球固定肝素酶I的方法，包括下述步骤：

（1）肝素酶I溶液的制备：选择Tris-HCl缓冲液（pH7.0,含CaCl₂）作为肝素酶I的溶剂，将肝素酶I溶解在该缓冲液中，制得肝素酶I溶液；

（2）肝素酶I与壳聚糖微球的交联：将壳聚糖微球用Tris-HCl缓冲液（pH 7.0, 含10mM CaCl₂）充分溶胀，再取步骤（1）获得的肝素酶I溶液 ，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联；

（3）用乙酸-乙酸钠和Tris-HCl两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球至洗脱液无酶活性；

（4）利用还原剂对步骤（3）中获得的固定了肝素酶I的壳聚糖微球进行处理，随后，如果需要，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶I。

在上述实施方案中，优选步骤（1）中用于溶解肝素酶I的溶剂Tris-HCl的浓度为10-100mM, CaCl₂浓度为10-50mM，最优选50mM Tris-HCl（pH 7.0,含10mM CaCl₂）；

在上述实施方案中，优选步骤（1）中肝素酶I在溶液中的浓度为0.1-100IU/ml，更优选为1-10 IU/ml，最优选为2-5 IU/ml。

在上述实施方案中，步骤（2）中所述壳聚糖微球可以通过现有技术中已知的制备方法进行制备，例如，可以采用反相悬浮法进行制备，其中使用的交联剂可以由本领域技术人员适当选择，例如应用最为广泛的交联剂为戊二醛。所述溶胀时间可以根据溶胀程度由本领域技术人员进行控制，例如，溶胀20分钟。

在上述实施方案中，优选步骤（2）中使用的壳聚糖微球与肝素酶I溶液的体积比为1/10-10/1，更优选1/5-5/1，最优选1/2-2/1。

在上述实施方案中，优选在步骤（2）中，交联温度为4-10℃，交联时间为8-24h，更优选的交联温度为8-10℃，交联时间为12-20h。