[发明专利]肝素酶I的固定化方法

权利要求书

1.一种肝素酶I的固定化方法，包括下述步骤：

（1）肝素酶I溶液的制备：选择Tris-HCl缓冲液（pH7.0,含CaCl₂）作为肝素酶I的溶剂，将肝素酶I溶解在该缓冲液中，制得肝素酶I溶液；

（2）肝素酶I与壳聚糖微球的交联：将壳聚糖微球用Tris-HCl缓冲液（pH 7.0, 含10mM CaCl₂）充分溶胀，再取步骤（1）获得的肝素酶I溶液 ，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联；

（3）用乙酸-乙酸钠（pH 6.5-8.0,含NaCl）和Tris-HCl（pH 6.5-8.0,含CaCl₂和NaCl）两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球，至洗脱液无酶活性；

（4）利用还原剂处理步骤（3）中获得的固定了肝素酶I的壳聚糖，随后，如果需要，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶I。

2.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（1）中用于溶解肝素酶I的溶剂Tris-HCl的浓度为10-100mM, CaCl₂浓度为10-50mM。

3.根据权利要求2的固定化方法，其特征在于，步骤（1）中使用的Tris-HCl溶剂为50mM Tris-HCl（pH 7.0,含10mM CaCl₂）。

4.根据权利要求1～3任一项的固定化方法，其特征在于，步骤（2）中使用的壳聚糖微球与肝素酶I溶液的体积比为1/10-10/1，更优选1/5-5/1，最优选1/2-2/1。

5.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（3）中使用的乙酸-乙酸钠缓冲液为50-150mM乙酸-乙酸钠（pH 6.5-8.0,含50-200mM NaCl）缓冲液。

6.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（3）中使用的Tris-HCl缓冲液为50mM Tris-HCl（pH 6.5-8.0,含10-100mM CaCl₂，50-200mM NaCl）缓冲液。

7.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（4）中使用的还原剂为碱金属硼氢化物。

8.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1a）、壳聚糖微球的制备：

取壳聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将Span 80加入液体石蜡中，高速搅拌混合，将酸性壳聚糖溶胶逐滴加入液体石蜡中，乳化1h后，加入戊二醛作为交联剂，交联温度为40℃，交联完毕后加入2.5M NaOH和无水乙醇（体积比1/1）的混合液，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球；

（1）配制缓冲液50mM Tris-HCl（pH 7.0,含10mM CaCl₂），将其作为肝素酶I的溶剂，制得肝素酶I溶液，调整浓度至酶活力2-5IU/ml；

（2）取步骤（1）获得的肝素酶I溶液 ，将其加入用50mM Tris-HCl（pH 7.0,含10mM CaCl₂）充分溶胀过的步骤（1a）获得的壳聚糖微球中，壳聚糖与肝素酶的体积比为1/2-2/1，4-10℃交联12-20h；

（3）配制100mM乙酸-乙酸钠（pH 7.5,含100mM NaCl）和50mM Tris-HCl（pH 7.5,含50mM CaCl₂，100mM NaCl）缓冲液，先后对交联后的壳聚糖微球进行洗涤，缓冲液100mM乙酸-乙酸钠（pH 7.5,含100mM NaCl）洗脱体积为壳聚糖微球体积的两倍，然后用缓冲液50mM Tris-HCl（pH 7.5,含50mM CaCl₂，100mM NaCl）洗涤，收集洗脱液测酶活，直至洗脱液中无游离酶；

（4）在固定了肝素酶I的壳聚糖微球中加入NaBH₄1-5mg/ml，反应1-3h，反应完毕后，以50mM Tris-HCl（pH 7.0,含10mM CaCl₂）为缓冲液，对壳聚糖微球进行洗涤，所用缓冲液体积是壳聚糖微球体积的3-5倍，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶I。