[发明专利]一种新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。

背景技术

目前的猪胰岛细胞培养体系就是从动物体中取出胰腺分离出胰岛细胞，并将其培养于CMRL1066,RPMI等培养基内维持其生长或诱导其定向分化的过程，培养的胰岛细胞一般用于移植手术治疗糖尿病。现今有多种新生猪胰岛细胞培养方法，一般采用1-5天的新生猪，解剖取胰腺，破碎后用胶原酶消化成细胞团，置于细胞培养基中培养3-5天，但纯化获得的有活性功能胰岛细胞的量各不相同（2000IEQ/g-4000IEQ/g），培养胰岛细胞的纯度也各有差别（70-90%）。胰岛细胞即使在低温培养中也会因细胞凋亡而产生丢失，尤其是β细胞，并且培养过程长短难于选择，培养时间短则β细胞不能发育成熟，培养时间过长则会有大量胰岛细胞因凋亡产生丢失，一般回收率只有60%左右，且由于β细胞凋亡使得同等量胰岛细胞胰岛素分泌量减少（insulin/DNA值为49.00±1.95mIU/g）。培养过程难于清除污染，易于给后续的移植过程带来炎症反应。现今没有能大量提供高纯度有活性并且稳定产量的胰岛细胞培养方法，所以如何通过建立优化的培养基成分以及培养方式成为胰岛细胞培养最迫切的问题。

发明内容

本发明旨在建立一种改良的能大量提供有活性并且有稳定产量的新生猪胰岛细胞培养体系。

本发明的新生猪胰岛细胞培养基为，向HAM’S/F-10培养基中添加细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK 10微摩尔～50微摩尔，占培养基体积百分比15%～25%的人血白蛋白和占培养基体积百分比为5%～15%猪血清，以及每升培养基中加入6～10mmol的丙酮酸钠。

优选的是人血白蛋白为20%；所述的猪血清为10%，所述的丙酮酸钢为8mmol。

本发明使用过程是，室温无菌条件下，将已分离纯化的（5000～10000IEQ）猪胰岛细胞悬液加入本发明所述的培养基中，在37℃、5%CO₂、95%空气培养箱内培养，制备的细胞在第一天更换培养皿及培养基，此后每隔一天更换一次。该优化培养基降低了细胞凋亡率，增加了培养细胞回收率，延长了细胞培养时间，使得培养后胰岛细胞较短时间培养的更为成熟，相同量胰岛细胞的胰岛素分泌量显著提升，建立了稳定高效，细胞获得量大的长期胰岛细胞长期培养体系。

细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK，分子式为Z-Val-Ala-Asp-CH₂F，即C₂₁H₂₈FN₃O₇，分子量为453.5，纯度>95%。

与以往技术相比的有益效果

1细胞凋亡下降，回收率增加。

2培养时间延长，培养细胞有敏感葡萄糖刺激应答，功能比一般培养的胰岛细胞要成熟。

3相同量的胰岛细胞胰岛素分泌量增加。

4胰岛β细胞活力增加。

具体实施方式

本发明针对已分离纯化的新生猪胰岛细胞悬液含10000IEQ(IEQ为胰岛当量，按细胞团大小来计算），将所述的悬液加入培养基HAM’S/F-10（从thermo公司购得)、10%猪血清、0.1%谷氨酰胺、80U/ml青霉素、100U/ml链霉素，并且添加有Z-VAD-FMK 10微摩尔～50微摩尔（上海碧云天生物技术有限公司购得）、20%人血白蛋白、8mM丙酮酸钠的培养皿。置于37℃、5%CO₂、95%空气培养箱内培养，制备的细胞在第一天更换培养皿及培养基，此后每隔一天更换一次，于培养第10天时收集细胞计数并做相关检测。细胞计数检测方法为常规台盼蓝（分子式C34H24N6O14S4Na4）染色（细胞悬液同4%台盼蓝液体比例为9：1），将27μl细胞悬液和3μl台盼蓝溶液混合，滴入市售的细胞计数板显微镜下计数，计数方法为一般光学显微镜下目测细胞计数板上四个对角上四个大正方形方格（由16个小正方形方格组成）中的细胞数，求平均数X，总细胞数为X×100000×细胞培养液总数。本发明分离纯化后胰岛获得量平均值为17805±2171.47IEQ/胰腺，即12187.41±2653.182IEQ/g胰腺。本发明通过向HAM’S/F-10培养基中添加细胞凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）、20%人血白蛋白、8mM丙酮酸钠以及10%猪血清，使培养7天的活性胰岛细胞回收率达到82%，比一般培养的胰岛细胞提高36.7%。本发明的方法与一般培养（3-6天）培养时间长（10天），培养10天获得的胰岛细胞对葡萄糖刺激具有敏感应答能力，并且培养10天的胰岛细胞中β细胞比例为94.65%，较一般培养的比例高。另外，insulin/DNA值为(66.45±2.17mIU/g)也相对于一般培养的胰岛细胞（49.00±1.95mIU/g）要高，证明本发明培养的胰岛细胞胰岛素分泌量明显增多（P<0.05），弥补了一般培养的胰岛细胞因凋亡导致胰岛素分泌下降的不足。