[发明专利]一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，属于食品安全监督或食品分析的免疫分析技术领域。

背景技术

庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，抗生素作为兽药和饲料添加剂被广泛应用，可能会造成抗生素在动物源性食品中的残留。对于牛奶等乳制品，抗生素残留不仅会影响乳制品的品质，如严重影响发酵乳制品的生产，降低产量及破坏后期产品风味，给生产者造成经济损失，而且会对人体造成极大的危害，如引起人体的过敏反应（如：皮疹、过敏性休克等），抑制肠道中正常的敏感菌群的生长，使致病菌、念珠菌大量增殖而导致全身或局部感染，并且会导致人体对抗生素产生抗药性，给临床治疗带来不可估量的危害。目前，牛奶、蜂蜜、家禽、水产中的抗生素残留已引起消费者的高度重视，因此，加强抗生素的残留检测尤为重要。

庆大霉素常用的检测方法有：理化检测法和免疫法。理化检测法以HPLC和HPLC-MS为主，但是该法对设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高，操作繁琐，不适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可半定量或定量检测动物源性食品中庆大霉素含量的可视化蛋白芯片方法，在于弥补现有抗生素同时半定量、定量检测技术的空白。满足对该种抗生素进行快速筛选的要求，提供一种快速，高灵敏度，低成本的检测动物源性食品中庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

方法一：定量检测方法。

一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，该方法依次顺序包括如下步骤：

(1)以牛血清白蛋白（BSA）为空白对照，将牛血清白蛋白和庆大霉素-载体蛋白偶联物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入10~50μL的牛血清白蛋白和10~50μL的庆大霉素-载体蛋白偶联物，将点好的玻片放在4℃冰箱中固定过夜；

(2)固定后每个反应孔内加入10~100μL 1~50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭1~3h，然后PBST洗涤3-4次，每次3-15min；封闭的目的是防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性；

(3)在部分反应孔内加入10~100μL庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入10~100μL庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔20~37℃水浴反应1~3h，然后PBST洗涤3~4次，每次3~15min；

(4)在每个反应孔内加入10~100μL胶体金标记羊抗鼠IgG，20~37℃水浴反应1~3h，然后PBST洗涤3~4次，每次3~15min；

(5)在每个反应孔内加入10~100μL银增强显色剂，避光显色反应5~30min后，终止反应；

(6)用CCD平板扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的庆大霉素包被抗原的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中庆大霉素的含量。

方法二：半定量和定量检测方法。

一种动物源性食品中残留庆大霉素的可视化蛋白芯片检测方法，该方法依次顺序包括如下步骤：

(1)以牛血清白蛋白（BSA）为空白对照，将牛血清白蛋白、庆大霉素-载体蛋白偶联物和不同浓度鼠IgG内标物通过生物芯片点样仪进行点样操作，点样板孔内分别加入10~50μL的牛血清白蛋白和10~50μL的庆大霉素-载体蛋白偶联物，以及10-50μL4个不同浓度的鼠IgG内标物，将点好的玻片放在4℃冰箱中固定过夜；

(2)固定后每个反应孔内加入10~100μL 1~50mg/mL的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭1~3h，然后PBST洗涤3-4次，每次3-15min；封闭的目的是防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性；

(3)在部分反应孔内加入10~100μL庆大霉素抗体和不同浓度的游离庆大霉素的标准溶液，在剩余反应孔内加入10~100μL庆大霉素抗体和样品溶液，所有反应孔20~37℃水浴反应1~3h，然后PBST洗涤3~4次，每次3~15min；

(4)在每个反应孔内加入10~100μL胶体金标记羊抗鼠IgG，20~37℃水浴反应1~3h，然后PBST洗涤3~4次，每次3~15min；

(5)在每个反应孔内加入10~100μL银增强显色剂，避光显色反应5~30min后，终止反应；