[发明专利]一种检测黄热病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测黄热病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测黄热病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种检测黄热病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、选择黄热病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：

正向引物：CGGGATCCTGGAAGATGAAAACTGGACGC<SEQ ID NO.3>

反向引物：ACGCAAGCTTTTATAACTTTGCGGTCCCCCTGGA<SEQ ID NO.4>。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达载体为pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。

6.一种黄热病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于：所述抗体检测板上包被有检测黄热病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中ELISA反应液包括：酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为黄热病毒抗体标准品，阴性对照为黄热病毒抗体阴性血清。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于:所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。

9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤：

一、重组抗原蛋白的制备，包括如下步骤：

(1)、选择黄热病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；

(2)、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；

(3)、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

(4)、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列；

二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4℃包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37℃封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板。

10.如权利要求1或2所述的重组抗原蛋白在制备诊断黄热病毒试剂盒中的运用。