[发明专利]定向诱导合成金属硫蛋白的工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种定向诱导合成金属硫蛋白及分离纯化工艺。

背景技术

金属硫蛋白是一种含有大量Cd和Zn的蛋白质，广泛存在于生物体内。金属硫蛋白相对分子质量6000~10000，富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量结合金属离子，具有很强的生物活性。

大量研究结果表明，金属硫蛋白有下列功能：1、清除自由基，拮抗电离辐射；2、参与微量元素的贮存、运输和代谢；3、重金属的解毒作用；4、参与激素和发育过程的调节，增强机体对各种应激反应；5、参与细胞DNA的复制和转录，蛋白质的合成与分解，以及能量代谢的调节过程。

201110076199.2公开了一种虫草金属硫蛋白的生产方法。生产步骤为：虫草菌—液体培养—过滤—含金属硫蛋白菌体—研磨—有机物变性—去杂蛋白—加热变性—除变性蛋白—超滤浓缩—层析—冷冻干燥成品。

201110063616.X公开了嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺，工艺过程为菌株筛选—培养—细胞破壁—凝胶过滤—离子层析—冷冻干燥成品。

200910308720.3 公开了从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法。该方法利用富含金属离子生物诱导剂的培养基加入家蝇幼虫培育出成虫，再经漂洗、灭菌、均浆、膜过滤、分离、浓缩、冷冻干燥成品。

01128543.5 公开了液体涂层发酵转基因工程菌生产人或动物金属硫蛋白制品的方法。该方法是将转基因工程菌通过深层发酵、培养工程菌、过滤、洗涤、冷冻干燥成品。

200910309136.X 公开了一种富锌黄粉虫的饲养方法，该方法包括幼虫养殖、富锌养殖，大龄黄粉虫用硫酸锌水溶液饲喂得富锌黄粉虫。

200910309135.5 公开了一种富硒黄粉虫的饲养方法，该方法包括幼虫养殖、富硒养殖，大龄黄粉虫用亚硒酸钠水饲喂，得富硒黄粉虫。

01131966.6公开了金属硫蛋白的制备方法，该方法选择金属硫蛋白工程菌，接种于培养液，收集菌体，超声破碎，层析分离，梯度洗脱，收集目标蛋白。

金属硫蛋白是一种用途广泛的金属蛋白物，但是由于来源的局限性，科技人员一直在研究开发产生金属硫蛋白的原料，产率和效率是一个长期关注的问题。

发明内容

针对现有金属硫蛋白来源的局限性，本发明提供一种定向诱导合成金属硫蛋白的工艺。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：1、选择合适的原材料配制培养基；2、培养基二次发酵复制；3、九龙虫虫卵培殖；4、九龙虫虫卵植入复制培养基中；5、超声波振荡培育；6、九龙虫成虫处理；7、微滤与超滤；8、超声驻波液相制备色谱分离纯化；9、冷冻干燥至成品；具体步骤如下：

（1）选择合适的原材料配制培养基，所述培养基由1000g麦麸或米糠、50~200g大豆豆粉、0~20g赖氨酸、0~20g甘氨酸、10~80g胱氨酸、10~20gCuSO₄、5~20gNaCl、0~20gCdSO₄、0~10gCaSO₄、0~20gZnSO₄混合而成；

（2）上述培养基喷淋去离子水，保持温度25~45℃，时间48~120h，使培养基充分发酵；

（3）将九龙虫雄虫与雌虫按2：3比例混合，保持温度25~30℃，湿度60~85%，雄虫与雌虫交配5~7天产卵，虫卵在8~12天孵化出幼虫，收集幼虫；

（4）将5~8g幼虫置于前述的发酵培养基中，保持温度20~30℃、湿度60~85%培养，待幼虫第一次脱皮后超声波振荡培育；

（5）待幼虫脱皮6次后的第4~6天，收集九龙虫幼虫，用去离子水清洗，甩干九龙虫幼虫表面水分；

（6）甩干的九龙虫幼虫捣碎，加热80~100℃，时间5~10min，离心分离，收集分离液；

（7）分离液进行微滤与超滤处理，收集浓缩液；

（8）100mL浓缩液溶于1000~2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里连续分离纯化金属硫蛋白；

（9）将分离纯化的金属硫蛋白冷冻干燥至成品。