[发明专利]一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别涉及一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法。 

背景技术

B型流感嗜血杆菌(Hib)是流感嗜血杆菌中具极强侵袭力的一种，在流感嗜血杆菌引起的严重感染中，几乎90%是由B型引起的，主要引起脑膜炎、肺炎、心包炎、关节炎、菌血症、会厌炎等疾病，该病使15%至35%的存活者患有终身残疾，典型的病症有精神发育迟滞或耳聋。B型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎是导致婴幼儿死亡的主要原因。 

多年流行病学研究表明，使用Hib疫苗是控制Hib侵袭性疾病的有效措施。因此研发效果好、成本低的Hib疫苗是必要的，也是重要的。 

国内已经上市的B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗,系用纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与破伤风类毒素共价结合而成。随着大量的结合疫苗使用以及基础免疫中百白破的使用，目前以TT作为载体存在一些明显的劣势。目前国际市场上存在的Hib结合疫苗主要有三种载体蛋白，TT、DT、CRM197以及OMP。 

现有Hib结合疫苗的生产技术，主要包括菌种的选育培养，荚膜多糖的提取分离纯化，载体蛋白的培养、分离纯化，荚膜多糖和载体蛋白的结合，以及疫苗的分离纯化等步骤，其中关键步骤存在工艺复杂，成本高，质量不稳定等缺陷。 

本发明设计了不含动物源、有利于嗜血杆菌生长和PRP分泌的新培养基，此培养基完全不同于此前大家普遍采用的动物源BHI培养基。 

本发明提出了新的PRP提取途径的荚膜多糖提取方法，此工艺的优点为处理量大，流程简单，回收率高，而且对内毒素也有部分去除能力。 

本发明载体蛋白纯化工艺解决了蛋白纯化回收率低，蛋白纯化过程中活性丧失以及蛋白降解等困难，实现了高纯度（达90%以上），短流程。 

本发明公开使用CDAP活化PRP，并连接CRM197蛋白或TT蛋白的方法。 

发明内容

本发明提供一种B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括：菌种的选育培养，荚膜多糖的提取分离纯化，载体蛋白的培养、分离纯化，荚膜多糖和载体蛋白的结合，以及疫苗的分离纯化的步骤。 

本发明在于提供以下制备方法： 

1）B型流感嗜血杆菌的培养（购买至ATCC）； 

2）B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP的提取； 

3）取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1-3min；加NaOH调节 

pH至8-11，维持1-5min；加入CRM197，加NaOH调节pH至8-11，反应； 

4）分离纯化得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗原液。 

其中，优选的步骤3)为：取PRP用水溶解，不断搅拌加入适量CDAP，维持1-2min；NaOH调节pH至9-10，维持2-4min；加入CRM197，加NaOH调节pH至9-10，反应；特别优选的步骤3)为：PRP用超纯水溶解至25mg/ml，不断搅拌加入CDAP，其中PRP与CDAP的重量比为1:1.25，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；加入CRM197，加0.3M NaOH调节pH至9.5，反应；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化，收集Vo附近液体，得B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗。 

本发明也包括，其中步骤3中的CRM197蛋白可用TT蛋白代替，具体工艺如下: 

A.取B型流感嗜血杆菌的多糖提取物即PRP，室温下用超纯水或注射用水溶解PRP多糖至20mg/ml，不断搅拌的情况下按照PRP与CDAP的质量比为1的条件下加入CDAP，维持1.5min；0.3M NaOH调节pH至9.5，维持3min；按照ADH与PRP多糖质量比为4：1的条件，加入固体ADH。0.3M NaOH调节pH至9.5，维持1h；2-8℃，0.2M NaCl透析； 

B.透析后的PRP-AH与20mg/ml TT溶液以质量比1：2混合；0.1M HCL调节pH至5.0，然后按照EDAC与PRP质量比为10：1的比例加入固体EDAC，室温下维持pH5.060min，0.3M NaOH调节pH至7.5反应30min；利用4FF凝胶色谱柱进行纯化。 

其中，步骤b)中PRP多糖的制备方法如下：