[发明专利]环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相的制备方法，具体地说是以三氯聚氰作为交联剂，将人血清白蛋白交联到环糊精键合球形硅胶上，得到环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相。

背景技术

手性是生命过程的基本特征，构成生命体的基本物质如蛋白质、多糖和核酸等都具有手性。手性化合物的两个对映体呈镜像异构，性质却不同甚至完全相反，如手性药物，其对映体在药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性等方面存在明显差异。所以，手性化合物越来越受到人们的重视，特别是对手性药物进行快速分离和测定，已成为研究者们关注的热点。

目前已经出现了很多的手性药物分离技术：气相色谱法（GC）、毛细管电泳法（CE）、超临界流体色谱法（SFC）等。但是，高效液相色谱（HPLC）法由于对各种分析物具有通用性、灵活性，且操作较简便，是最常见的应用技术。

 环糊精因其特殊的分子结构而具有良好的手性识别性能，使之广泛应用于手性化合物的拆分，但其包合客体分子的范围有限、溶解度较低等问题使它的应用产生一定的局限性。为了改变环糊精的这种特性，加强环糊精的拆分能力，扩大其应用范围，人们用不同方法对它进行改性，在一定程度上改善了环糊精的理化性能，使其具有更好的包合选择性，在各个领域的应用更具优越性。

 蛋白质是一类天然的高分子聚合物，结构复杂，具有独特的三维结构，是对映异构体的天然识别体。蛋白质的这种独特的立体选择性，使其成为高效液相色谱分离中最具吸引力的手性固定相之一，在手性药物的拆分中发挥着重要的作用。但其也存在很多不足，如：稳定性差、柱容量和柱效低等。蛋白质本身固有的性质，如不适于高温、有机溶剂以及过酸或过碱等，也限制了它的应用范围。蛋白质通过交联剂与环糊精复合后，将大大改善其不足，环糊精具有稳定化作用，可以提高蛋白质的热稳定性以及酸碱稳定性等。

 人血清白蛋白(HSA)是最常使用的血清蛋白之一，它具有类似雪茄形状的分子外形，其相对分子质量大约为66500，是由685个残基组成的单纯蛋白质，单条多肽链由大约17个二硫键交叉连接，使整个肽链折叠成3个相似的区域，每个区域又由3个相似的环组成，每分子只含有一个游离硫氢基。HSA曾被固载在硅胶上用于手性分离。

 环糊精和蛋白质复合手性固定相的合成与研究具有重要意义，它结合了环糊精和蛋白质的独特性质，从而提高了手性固定相的选择性和稳定性。该复合固定相增加了手性识别位点，蛋白质的稳定性大大增强，可提高色谱柱的使用寿命。

发明内容

 本发明的目的是提供一种操作简便、具有良好应用前景的环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相的制备方法，以提高手性固定相的选择性和稳定性，特别适用于在亲水液相色谱模式下分离强极性化合物。

 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：首先制备环糊精键合球形硅胶，然后以三氯聚氰作为交联剂，将人血清白蛋白键合到环糊精键合球形硅胶上，得到环糊精/人血清白蛋白复合的手性固定相。本发明所提供的键合反应选择性高，反应条件温和，操作简便，所制备的环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相手性识别位点增多，并使蛋白质的稳定性得到提高，特别适用于在亲水液相色谱模式下分离强极性化合物。

 具体制备步骤如下：1).环糊精键合球形硅胶的制备：环糊精和氢化钠于有机溶剂中反应1~3h后，过滤，滤液置于烧瓶中，氮气保护下加入硅烷偶联剂，100~120℃下反应3~6h，加入活化硅胶，继续反应20~25h。反应液冷却后用G5砂芯漏斗过滤，并依次用DMF、甲醇、二次蒸馏水、丙酮洗涤，所得固体产物50℃真空干燥10~15h，即得环糊精键合球形硅胶。

 步骤1）所用硅烷偶联剂为KH-560，所用的环糊精为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精，所用的球形硅胶是全多孔硅胶小球，粒径为5~40微米，孔径为60~300埃。

 步骤1）中环糊精，氢化钠，硅烷偶联剂的摩尔比为1:1:1，所用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需有机溶剂的量为10~30mL。

 2). 环糊精键合球形硅胶与交联剂反应：将步骤1)中所得环糊精键合球形硅胶与交联剂在冰水浴条件下反应2~5小时后，过滤，丙酮洗涤,真空干燥。

 步骤2）中所用的交联剂为三氯聚氰，所用的有机溶剂为丙酮。

 3).环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相的制备：将步骤2)中所得产品与人血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液在20 ~40℃下反应2~5小时后，将产物抽滤洗涤，即得到环糊精/人血清白蛋白复合手性固定相。