[发明专利]诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白；此外，本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。

背景技术

细粒棘球蚴病又称囊型包虫病（cystic echinococcosis,CE）是一种由细粒棘球绦虫的幼虫引起的严重危害人体健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病，且已成为世界范围的一个重要的公共卫生、经济问题。我国是囊型包虫病发病最高的国家之一，其中以西部的新疆、青海、甘肃、宁夏、西川北部等地最为严重，流行区面积占全国总面积的44%以上，严重影响西部农牧民身体健康，是西部农牧区因病致贫、因病返贫的重要原因之一。目前CE确诊主要是通过物理影像，如X线、B超、断层扫描及核磁共振等方法，但由于细粒棘球蚴病患者早期无明显临床症状，这些方法也仅适用确诊中、晚期病患阶段，所以早期诊断对该病治疗和预后起着重要的作用。对临床早期可疑病患或对高风险人群进行大规模筛查采用免疫学检测显得尤为必要。目前广泛用于细粒棘球蚴病诊断抗原主要是囊液抗原及其组分抗原B和抗原5等，但受到不易标准化，特异性、敏感性不理想以及与其他带绦虫抗原存在交叉反应等问题的限制。寻找具有更高敏感性和特异性的抗原组分，提高对CE的诊断效率，是当前细粒棘球蚴病免疫诊断研究任务中的重要内容之一，而研制特异性快速诊断试剂盒也是目前免疫诊断的发展趋势。随着分子生物学技术的发展，用基因工程技术制备重组抗原有助于解决上述问题。

根据不完全统计，我国受细粒棘球蚴病威胁的人口在5000万人以上，但目前对于细粒棘球蚴病(囊型包虫病)的治疗效果尚不理想，所以早期诊断对于人囊型包虫病（CE）的及时治疗至关重要，而具有特异的免疫学诊断对CE的确诊有其重要作用。Enolase是利用免疫蛋白质组学技术用CE病人血清从原头节虫体蛋白中筛选出的一个抗原性蛋白分子，分子量约为50kDa，其编码基因为EgENO（细粒棘球绦虫烯醇酶），生物信息学分析显示EgENO含有多个B细胞抗原表位，并且蛋白质组分析显示Enolase也存在于原头节排泄分泌物中，提示该分子具有潜在诊断抗原价值。

寻找具有更高敏感性和特异性的CE诊断抗原，提高对囊型包虫病的检测效率，是当前细粒棘球蚴病免疫诊断研究课题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的用途。

为了解决上述技术问题，本发明从我国青海省细粒棘球蚴分离原头节cDNA扩增了ENO基因，克隆表达EgENO重组蛋白，通过ELISA方法评价分析重组抗原的诊断价值。

在本发明的一方面，提供一种诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。编码上述重组抗原蛋白的基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明提供一种重组质粒载体，其由上述编码重组抗原蛋白的基因与表达载体PET28a(+)连接构建。

所述的连接可以采用本领域常规或已知的方法进行，例如：所述的连接可以是将两侧带有限制性内切酶识别位点的细粒棘球蚴抗原蛋白基因与经相同酶切处理的表达载体PET28a(+)连接，构建重组表达质粒。所述的内切酶可以是本领域通常使用的内切酶，例如EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ。所述细粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR产物可以通过抽取细粒棘球蚴总RNA，反转录成cDNA作为扩增模板，通过PCR法进行扩增而得。

本发明提供一种转化体，其由上述重组质粒载体转化大肠杆菌BL21（DE3）而得。所述的转化可以按照本领域的常规或已知的方法进行。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断细粒棘球蚴病的引物，其序列为：

上游：5'-GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3'（如SEQ ID NO:3所示）或其互补链；

下游：5'-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3'（如SEQ ID NO:4所示）或其互补链。

在本发明的另一方面，提供一种上述诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：