[发明专利]一种猪小肠抗菌肽PR39的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪小肠抗菌肽PR39的制备方法，属于生物制药技术领域。

背景技术

近年来，猪病日益增多，尤其是药物的滥用使很多病菌产生了耐药性，一些变异毒株的出现更是给复杂的猪病预防增加了困难，对养猪业的发展产生很大阻碍仔猪腹泻及各种病毒性疾病如猪瘟呼吸与繁殖综合征等一直是养殖业棘手的疾病。目前，母猪和仔猪保健越来越被人们所认识，但这也是摆在人们面前的一个难题。抗菌肽的应用，能够很好地解决这个问题。

抗菌肽是生物体在抵御病原性微生物时产生的一类防御性小肽，是生物免疫防御系统的重要组成部分。广泛地存在于昆虫、植物、动物以及人体内。抗菌肽具有非特异性抗革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒的作用以及杀伤肿瘤细胞的作用，但对正常的真核细胞无毒或低毒。目前，抗菌肽广泛应用于动物基因工程、药物开发、工业、农业、畜牧业等多个领域。应用抗菌肽可以促使母猪发情，增加母猪奶水，提高仔猪整齐度，减少弱猪和僵猪，预防仔猪下痢、腹泻，同时还可以促进采食和提高生长速度。猪群出现疾病时，在饲料中添加抗菌肽或口服抗菌肽液，可以很快控制疾病蔓延并缩短恢复期，说明它对很多疾病有辅助治疗作用，临床上现在也开始应用抗菌肽预防和治疗很多疾病，诸如猪瘟，猪丹毒，猪链球菌病，附红细胞体病，蓝耳病等，都取得了极好的效果。

由于肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，目前采用的提取抗菌肽的技术，操作复杂，往往要经过多次分离纯化才能得到纯化的抗菌肽，浪费成本，而且收率也不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪小肠抗菌肽PR39的制备方法，以解决病毒对药物产生耐药性，降低成本，提高收率。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案在于提供一种猪小肠抗菌肽PR39的制备方法，具体步骤如下：

1）取猪小肠粘膜用灭菌生理盐水冲洗；

2）按照20ml/g的比例加入体积分数4-5%的乙酸冰水混合物，捣碎制匀浆；

3）90-100℃水浴10min，后迅速冷却至0-10℃；

4）离心，取上清液置冰上超声波裂解30s，4℃搅拌浸提，再离心，取上清液；

5）将离心的沉淀物用等体积的体积分数4-5%的乙酸混合，搅拌浸提，离心，取上清液；

6）合并步骤4）和步骤5）得到的上清液，调节pH=5-6.5，离心，取上清液；

7）将上清液上样于Sephadex G2100凝胶柱层析，收集洗脱液；

8）采用琼脂糖弥散方法检测各收集管液体的抗菌性，收集有抑菌作用的洗脱液，得到仔猪小肠抗菌肽PR39，真空冷冻干燥保存。

所述的Sephadex G2100层析洗脱液为0.2mol/L乙酸钠溶液，恒流泵的速度为30r/min。

所述的离心温度为4℃，转速为8000r/min，时间为30min。

本发明采用Sephadex G2100凝胶柱层析，与现有技术相比，一次性可以得到猪小肠抗菌肽PR39，去除了大分子物质，方法简单，节约了时间和成本，得到的猪小肠抗菌肽纯度更高。

本发明采用屠宰场废弃物的肠粘膜中提取抗菌肽，有效的利用了废弃物，不仅减少了环境的污染，而且变废为宝，具有良好的经济效益。本发明工艺简单，成本低廉，超声裂解是让其中的蛋白释放出来，采用分离柱层析去除了大多数的杂蛋白，可一次获得纯化的抗菌肽，提取率高。本发明制备的抗菌肽能克服抗生素所产生的耐药性和疫苗所产生的副作用的缺点，对机体没有毒害作用。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的猪小肠抗菌肽PR39的制备方法，具体步骤如下：

1）取猪小肠，去掉脂肪和内容物，称取20g小肠粘膜，用灭菌生理盐水冲洗；

2）按照20ml/g的比例加入体积分数5%的乙酸冰水混合物，经组织捣碎机制成匀浆；

3）100℃水浴10min，后迅速冷却至0℃；

4）4℃，8000rpm离心30min，取上清液置冰上超声波裂解30s，4℃搅拌浸提，8000rpm离心30min，取上清液；

5）将离心的沉淀物用等体积的体积分数5%的乙酸混合，再次搅拌浸提，8000rpm离心30min，取上清液；

6）合并步骤4）和步骤5）得到的上清液，调节pH=6，8000rpm离心30min，取上清液；

7）将上清液上样于Sephadex G2100凝胶柱层析，用0.2mol/L乙酸钠洗脱，恒流泵的速度为30r/min，经核酸蛋白检测仪检测后用自动收集器收集，每管1.5mL；