[发明专利]一种聚乙二醇选择性修饰蛋白C端羧基的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质化学，生物医学领域，涉及一种聚乙二醇(PEG)选择性修饰蛋白质C末端羧基的修饰方法。

背景技术

利用分子生物学、结构生物学、分子免疫学、基因工程、蛋白质工程、单克隆抗体等技术开发的生物药物，可使多种疾病的治疗成为可能。其中，基因重组蛋白质和多肽药物是最为突出的一类生物药物。自第一种基因工程药物重组人胰岛素于1982年上市至今，大量基因重组蛋白质和多肽药物已用于临床研究，并取得了巨大的成功。与传统的小分子化学药物相比，生物药物在分子结构和/或生物学功能方面与内源性蛋白质相同或接近相同，因此具有生物效应显著、疗效确切、副作用小等优点。然而生物药物普遍存在给药困难、抗原-抗体反应、体内循环半衰期短、生物利用度低等问题。目前，已经开发了多种技术来改善生物药物的性能，如缓控释微球技术、埋植剂技术、原位微球技术、脂质体包埋技术、纳米球技术及化学修饰技术。其中聚乙二醇(PEG)修饰技术是目前应用最为成功的技术之一。

PEG是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。PEG共价修饰可以增加蛋白质的体内循环半衰期、减小其抗原性、增加其溶解性、改变其在体内的生物学分布。1977年，Davis等人(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581)首次报道了PEG修饰蛋白质。随后，PEG修饰技术在生物医学和生物技术领域得到了广泛的应用。PEG修饰技术已经成为改善蛋白质药物的药代动力学/药效动力学性质最有效的方法之一。目前，已有多种PEG修饰的蛋白质药物被美国FDA批准上市，如PEG修饰人生长激素受体拮抗剂(美国Pfizer公司，商品名为Somavert)，用于治疗肢端肥大症和超常增生症；PEG修饰α-干扰素(美国Schering-Plough公司，商品名为PEG-Intron)，用于治疗丙型肝炎。

PEG修饰主要是修饰蛋白质和多肽的氨基(包括N端α-氨基的酰基化修饰与烷基化修饰、赖氨酸侧链ε-氨基的酰基化修饰)、羧基和巯基等。其中在赖氨酸侧链的ε-氨基上进行的修饰反应是随机修饰反应。由于蛋白质通常含有多个赖氨酸残基，且通常位于蛋白表面，因此易与PEG修饰剂发生反应，且反应迅速，修饰率高。但由于是随机修饰，所以PEG修饰产物的组成比较复杂，修饰产物的位点也不均一。这些异构体的生物活性往往不尽相同，导致规模化制备时难以实现批次间的稳定性，不符合药物生产和新药申报的要求。

另一类反应是PEG定点修饰，主要包括N末端α-氨基的修饰和半胱氨酸残基的修饰。N末端α-氨基的修饰通常是通过还原剂(如氰基硼氢化钠)与PEG-醛这一类的修饰剂进行还原烷基化反应。这种修饰反应并不完全是特异性的，蛋白质侧链的赖氨酸残基也会参与反应。在单修饰产物中，修饰在N末端的比例通常占85%以上。而半胱氨酸残基修饰是利用修饰剂，如单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-Mal)与蛋白质分子的游离巯基发生反应。这种修饰反应的特异性非常高。但是大多数蛋白是不含自由巯基的，需要通过基因工程的方法在蛋白质分子上引入半胱氨酸。然而，引入的半胱氨酸容易造成蛋白质天然二硫键的错配，同时形成分子间的二硫键，从而影响蛋白质的生物活性。

目前还有一种可以修饰蛋白质羧基的方法。该方法利用己二酰肼和碳二亚胺(EDC)与蛋白质的羧基反应，引入酰肼基团后与PEG醛发生修饰反应。然而，该修饰方法需要加入大量的己二酰肼和碳二亚胺，修饰反应的选择性差，易与天冬氨酸和谷氨酸侧链的羧基反应，还会发生蛋白分子内和分子间交联(J.Mol.Recognit.1996,9:644-651)。

本发明以葡激酶为模式蛋白。葡激酶(staphylokinase，SAK)是一种由某些金黄色葡萄球菌分泌的非酶类蛋白，分子量为15.5kDa，本身没有酶活性，当它与纤溶酶原(Plg)结合后能激活纤溶酶原，使之成为有活性的纤溶酶而发挥溶栓作用(图1)。葡激酶是国家一类新药，用于治疗心脑血管血栓性疾病，已成为近年来新型溶栓剂研制的热点之一。PEG修饰可以延长葡激酶在体内的循环半衰期，由于其活性中心在N端，因此选择远离活性中心的C端羧基作为修饰位点。