[发明专利]胎盘全细胞冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法有效
申请号: | 201210292509.9 | 申请日: | 2012-08-16 |
公开(公告)号: | CN102807966A | 公开(公告)日: | 2012-12-05 |
发明(设计)人: | 林卓衡;朱业峰;陈俊峯;周丹 | 申请(专利权)人: | 博雅干细胞科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/073 | 分类号: | C12N5/073;C12N5/0735;C12N5/0775;A01N1/02;G06F17/30 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 胎盘 细胞 复苏 以及 分离 扩增 干细胞 方法 | ||
技术领域
本发明涉及对胎盘全细胞进行处理的方法,具体涉及对胎盘全细胞冻存、复苏处理,以及由复苏后的胎盘全细胞分离和扩增干细胞的方法,特别涉及对胎盘全细胞进行冻存、复苏,然后再从中分离和扩增间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层,具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点,日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复,尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。
MSC在骨髓中蕴含丰富,但随着年龄的老化,骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外,骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应,且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题,都直接影响了骨髓MSC的临床应用,使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。
近期的研究显示,胎盘组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性,而且分离出来的干细胞更原始,有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低,大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单,对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令胎盘间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。
但是,胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟,而且每一份胎盘组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将胎盘组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此,本领域需要一个简单和高效的胎盘组织冻存、复苏和间充质干细胞的分离和扩增的方法,以满足医药、科研、临床等领域的需求。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术冻存、复苏胎盘全细胞方法的缺陷,提供一种简单有效的胎盘全细胞冻存的方法,以及相配套使用的冻存胎盘全细胞复苏的方法,以及复苏后间充质干细胞扩增的方法。本发明发现对胎盘全细胞使用特定操作步骤的冻存、复苏以及分离和扩增,可简单、有效地从胎盘组织例如胎盘全细胞分离原代间充质干细胞,并且可以对原代间充质干细胞在冻存过程中有效地进行保护。本发明基于此发现而得以完成。
因此,本发明第一方面提供了处理胎盘全细胞的方法,该方法包括以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤:
(1)胎盘组织清洗:通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织,使胎盘组织表面残留血液冲洗干净,胎盘表面无血液凝块;
(2)胎盘组织消化处理:从步骤(1)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶,加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎,加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中,消化处理5-40分钟(例如10-30分钟,例如约20分钟);
(3)胎盘组织过滤处理:加入FBS溶液(Gibco)终止消化,将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置,对胎盘组织碎片进行研磨,同时收集滤液,对滤液进行细胞清洗;
(4)配制胎盘全细胞冻存液:所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM-F12,配好的冻存液放在1℃至7℃(例如约4℃)的温度条件下低温冷藏;
(5)胎盘全细胞冻存:将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液,在0-15℃(例如1℃至7℃,例如约4℃)的低温环境下,加入步骤(4)得到的全细胞冻存液,然后转移至冻存容器中,冻存容器放入程序降温装置,先在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏0.2-2小时(例如约0.5小时),再在-10℃至-150℃(例如约-80℃)的温度条件下冷冻0.25-3天(例如约1天),然后将冻存容器于液氮中冷冻,备用。
根据本发明第一方面的方法,该方法还包括以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤:
(6)冻存胎盘全细胞复苏:将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出,解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化,利用间充质干细胞培养基清洗细胞,离心处理清洗DMSO,去除上清液,进行红细胞裂解步骤,离心处理后去除上清液,观察红细胞裂解情况,如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解,最后进行细胞清洗步骤,去除上清液。
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- 本发明涉及一种脐带组织清洗液及制备方法,清洗液包括生理盐水:100ml;青霉素:0.014~0.026g;氨基糖苷类抗生素:0.014~0.026g;多烯类抗生素:0.49~0.51mg。制备方法包括步骤1、按份制备清洗液;制作每份清洗液时分别按量称取组分中的药物;步骤2、将药物溶于生理盐水中,得到清洗液;步骤3、将每份清洗液分装并真空封口。本发明所述的清洗液中加入了多烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素以及青霉素,可针对性的防止脐带组织在清洗过程中被微生物感染,相对于普通的生理盐水冲洗,具有更好的抗菌效果。
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- 马雪云;刘腾飞 - 华东师范大学
- 2016-04-27 - 2019-06-14 - C12N5/073
- 本发明公开了一种大鼠体外受精营养液RTF(Rat Tube Fluid)及其在培养大鼠受精卵中的应用。本发明根据钠离子和钙离子在动物精卵结合中的特殊作用,结合大鼠精卵结合的特殊需求,提出了一种大鼠体外受精营养液。本发明的大鼠体外受精营养液使得大鼠的人工辅助生殖得以进行,能够实现保存品系后代的同时又实现了微生物学的净化。
- 一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法-201910165488.6
- 金晶;赵瑞丰;张晨;李碧春;张亚妮;左其生;孙红艳 - 扬州大学
- 2019-03-05 - 2019-06-04 - C12N5/073
- 本发明涉及一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法,属于生物技术领域。在注射管中塞入干净干燥的棉球,将针管式滤器的大头连接注射器的针口,将橡皮管一头连接针管式滤器的小头,另一头连接处理过后的玻璃管,用于直接挑取细胞。本发明中口吸管采用的材料均容易购买,且价格低廉。组装完成后,成品操作简单,使用者可以挑取特定单个细胞进行单克隆培养,所采用的重组口吸管适用于所有类型的细胞。
- 一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系-201410408788.X
- 王文秀;沈志强;于金枝 - 山东省滨州畜牧兽医研究院
- 2014-08-19 - 2019-05-17 - C12N5/073
- 本发明公开了一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系。本发明涉及一种建立鹅胚上皮细胞系的方法,其特征在于将原代鹅胚胎组织贴壁法、差速酶消化法和单克隆筛选方法相结合,优化了原代培养条件。此方法操作方法简便,便于推广应用。本发明还涉及所述方法建立的鹅上皮细胞系,其保藏号为CCTCC C2014137,该细胞系的建立解决了目前尚未有完善的鹅源细胞系的问题。本发明还涉及一种用于培养和/或增殖小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒及I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的待感染宿主细胞即为或包括所述的鹅胚上皮细胞系。本发明,验证了所述鹅胚上皮细胞系对小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒及I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒感染的敏感特性。
- 一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的培养液-201610134610.X
- 申重阳;陈洁;王仲;陈勇军 - 成都康景生物科技有限公司
- 2016-03-09 - 2019-05-14 - C12N5/073
- 本发明公开了一种维持人羊膜上皮干细胞多能性的培养液,包括:基础培养液;血清替代品15%~25%;非必需氨基酸0.1%~2%;必需氨基酸1mmol/L~5mmol/L;二硫苏糖醇0.01mmol/L~1mmol/L;生长因子30ng/ml~120ng/ml;体系稳定因子0.1%~2%。本发明的培养液可以模拟干细胞在体内的生存环境,进而使得干细胞在体外培养时可以维持干细胞多能性,经过较多次数的传代培养后,依然可以获得具有高多能性的干细胞。
- 一种无透明带细胞的束缚方法-201811549876.6
- 陈子江;李城;吴克良;马金龙 - 陈子江;山东山大附属生殖医院有限公司
- 2018-12-18 - 2019-05-10 - C12N5/073
- 本发明属于医疗领域,提供一种给无透明带细胞重造透明带束缚作用的方法,其要点包括:备用透明带的固定、备用透明带的开缝、备用透明带的牵拉开口、备用透明带内容物的吸出、无透明带卵子或受精卵的推入、透明带复原。本发明提供的透明带束缚方法,能够为无透明带细胞、如卵子或受精卵重造透明带束缚作用,从而增加了其后续的发育能力,有利于继续进行下一步的融合及囊胚发育,使得卵细胞能够得到更大程度的利用。
- 一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法-201811488196.8
- 刘国世;张珍珍;何长久;张鲁;吕东颖;朱天奇;吴昊;宋玉坤;姬鹏云 - 中国农业大学
- 2018-12-06 - 2019-04-30 - C12N5/073
- 本发明涉及一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法,所述方法为将胚胎在含有α‑酮戊二酸的培养液中培养,或在胚胎的培养过程中添加α‑酮戊二酸。通过在体外胚胎培养液中添加α‑酮戊二酸能够提高体外发育胚胎的囊胚率、孵化囊胚率、囊胚内细胞团细胞数和占细胞总数的比例,进而显著提高了胚胎移植的妊娠率。本发明提供的促进胚胎体外发育的方法,操作工艺简单易行,成本低廉,为进一步提高哺乳动物胚胎的体外培养和发育以及辅助生殖技术的发展提供了有效的方法和新的思路。
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