[发明专利]脂质超声微泡介导的腺相关病毒基因转染制剂及制备工艺

说明书

一、技术领域

本发明专利涉及一种基于腺相关病毒由脂质超声微泡介导的显著增强对具致密结构细胞的基因转导效率的新型制剂，属于生物医药技术领域。

 

二、背景技术

 目前，在基因治疗的研究中，安全有效的基因传递系统是人们关注的焦点。通常，根据载体的不同，可将基因传递系统分为病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体如脂质体、纳米粒、微囊、微球等具有使用方便，可大规模生产以及无免疫原性等优点，但其缺点是体内应用时转染效率较低。病毒载体中，使用得较为广泛的是腺相关病毒载体。研究者发现，腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)对各种理化处理稳定，易于分离纯化；宿主范围广，可感染非分裂细胞；无致病性，并且在宿主体内不会引发免疫反应；可将外源基因定点整合到人类19号染色体长臂，基因表达稳定。腺相关病毒载体已被应用于临床治疗囊性纤维化病。但是，以病毒做为载体，虽然基因转染效率相对较高，但其安全性和免疫原性是需要人们考虑的问题。由此可见，病毒载体和非病毒载体各有其优点和缺点，如果能通过一定的方式将两者整合在一起，将有望促使各自扬长避短，各施其能，各尽所长。

近年来，随着具有定向选择作用的靶向声学造影剂的问世，启迪人们借助于超声的无创性及其协同微泡的定向传输来建立一种新型的治疗性基因靶向传输系统。研究表明，用微泡造影剂作载体来携带基因一方面可保持这些治疗性物质的活性，避免它们从血循环中被清楚，尤其是在基因转运时，由于内源性核酸内切酶和电荷相关的肝脏清楚系统，使裸DNA和其他载体在血管内的稳定性差，很快被代谢；另一方面，对于形成致密结构（紧密连接）的细胞和组织如呼吸道上皮细胞，腺相关病毒无力提供理想的转导效率，我们借助于超声的无创性和利用超声携同微泡的定向传输建立了一种新型的腺相关病毒基因传输系统，即超声微泡基因传递系统。其中，在超声波作用下，超声微泡产生的“空化效应”作用于细胞膜，产生“外溢孔”，使细胞膜通透性增加，使微泡破坏后释放的基因能够进入血管壁甚至组织间隙从而促进基因跨膜转染。

三、发明目的

本发明的目的在于充分利用腺相关病毒载体高效率转导基因的优点，避免其免疫原性和毒性的产生，制备一种利用脂质超声微泡介导的通过超声微泡产生的“空化效应”作用于致密细胞的细胞膜的腺相关病毒转染制剂，从而显著增强对具致密结构细胞的基因转染效率。

四、发明内容

本发明涉及一种基于腺相关病毒，由脂质超声微泡介导的显著增强对具致密结构细胞的基因转导效率的新型制剂。该新型制剂结构组成如图1所示，包括三个部分：腺相关病毒，全氟丙烷，脂质双层。本发明利用腺相关病毒载体的高效转导基因的优势，在超声波作用下，通过超声微泡产生的“空化效应”作用于具致密结构细胞的细胞膜，产生“外溢孔”，细胞膜通透性增加，使微泡破坏后释放的腺相关病毒能够进入血管壁甚至组织间隙从而促进基因跨膜转染。

具体实施方式如下：

实施例1：载腺相关病毒脂质超声微泡的制备

精密量取一定比例的AAV，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，胆固醇衍生物胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)和甘油溶于PBS，在20℃水中混合10 min，冲入全氟丙烷气体，在室温水浴中用100W超声波清洗器超声，每超声20s间隔10s，共10个循环，即制得载AAV的脂质超声微泡。

实施例2：载药脂质微泡的形态观察、粒径分布检测

将新制备的脂质超声微泡密封置于4℃冰箱保存，分别于1h，24h，48h和2个月时间点取出，以PBS作适当稀释后置于倒置光学显微镜下观察其外观形态。为考察脂质超声微泡的浓度，将稀释液取1滴置于血球计数板上，计数8个大格的微泡数目然后取平均值(至少测3次)。并利用Malvern Sizer Nano ZS90粒度仪按照操作说明分析微泡粒径及分布。倒置光学显微镜观察显示，本实验制备的脂质超声微泡呈圆球形，大小均匀。放置1h，24h和48h后的脂质微泡镜下观察结果一致(图2)；放置2月后的脂质微泡大量聚集成团(图3)，由此说明本实验制备的脂质体超声微泡至少在48h内稳定，但不能长期存放。以血球记数仪检测微泡浓度为1.89±0.5×10⁹个/ml。Marlven粒度仪检测结果显示(图4)，本实验制备的脂质超声微泡平均粒径为2.46±1.2 μm，粒径分布呈正态分布，其结果与光学显微镜观察的结果一致。

实施例3：细胞培养