[发明专利]家兔血管内皮细胞RNA提取与纯化

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及从家兔中提取血管内皮细胞RNA的方法。 

背景技术

家兔动脉血管尽管比鼠类血管直径大，但是要得到足够的内皮细胞RNA却很困难。文献报道的酶解法和刮取法等，结果均不理想，很难避免平滑肌细胞的污染，而且RNA量很低，无法满足50种基因的PCR定量检测，如果要得到足够的高纯度的RNA标本，需要很多家兔才能满足需要，耗资较大(每只纯种家兔在美国需要200美元左右，完成7种血管的50种基因定量PCR测定，大约需要30-50只品种兔，花费在8000美元左右。为此，如何提取家兔血管内皮细胞RNA是亟待解决的问题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种家兔血管内皮细胞RNA提取方法，该方案提取率高，提取的RNA纯度高。 

本发明涉及一种家兔血管内皮细胞RNA提取方法，其特征在于包括如下步骤： 

首先从麻醉或者是屠宰的家兔体内获取7种不同的血管标本：左冠状动脉前降支、右冠状动脉、主动脉弓外环、主动脉弓内环、胸主动脉、腹主动脉、髂动脉； 

左、右冠状动脉：将心脏一分为二，左半侧有左冠状动脉前降支，右半侧有右冠状动脉，在动脉开口处的下方，水平剪开，用吸头的顶部连接 27#针头和注射器，将血管用PBS溶液冲洗3次，从冠状动脉的上部开口处，加入Trizol溶液，用无菌离心管收集流出物，置于冰上； 

主动脉弓：将主动脉弯曲部分剪下，用PBS冲洗3次，去掉血块，从中线处剪开为外环和内环将内，外环放入培养皿中，顺着血管弯曲的走向分别加入Trizol溶液，冲洗3次，流出物分装入2个无菌离心管中，置于冰上； 

胸、腹主动脉：隔肌以上为胸主动脉，隔肌以下为腹主动脉，分别用PBS冲洗3次，去掉血块，加入Trizol溶液冲洗2次，流出物分装入2个无菌离心管中，置于冰上； 

髂动脉：从腹主动脉与髂动脉分叉处剪断，用PBS冲洗3次，去掉血块，加入Trizol溶液冲洗2次，流出物装入2个无菌离心管中，置于冰上； 

上述分离到的样品内分别加入氯仿，混匀，室温存放3-5分钟，2-6℃离心13-17min，上清液中加入等体积的75％乙醇，混匀后将7种样品分别加入到质粒提取柱上，按质粒纯化步骤进行即得RNA。 

附图说明：

图1A：家兔内皮细胞RNA纯度检测结果； 

图1B、C：进行半定量RT-PCR检测内皮细胞基因的结果：R C右侧冠状动脉，L C左侧冠状动脉，I L髂动脉，O A主动脉弓外侧壁，IA主动脉弓内侧壁，A A腹主动脉，T A胸主动脉 M：标准DNA； 

图2：家兔动脉内皮细胞有关基因的定量检测。 

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 

首先获取家兔体内7种不同的血管标本：左冠状动脉前降支、右冠状 动脉、主动脉弓外环、主动脉弓内环、胸主动脉、腹主动脉、髂动脉根部接近腹主动脉分支处。 

*左、右冠状动脉：将心脏一分为二，左半侧有左冠状动脉前降支(LAD)，右半侧有右冠状动脉(RCA)，在动脉开口处的下方，水平剪开，便于流出物通过。用超细吸头(蛋白印迹上样用吸头)的顶部连接27#针头和1ml注射器，将血管用1ml冷PBS冲洗3次。从冠状动脉的上部开口处，加入500μl Trizol(Invitrogen)，用1.5ml无菌离心管迅速收集流出物，每管约750μl。放冰上。 

*主动脉弓：将主动脉弯曲部分剪下，即为主动脉弓，用2ml冷PBS冲洗3次，去掉血块。从中线处剪开为外环和内环。分别将内，外环放入4-5mm培养皿中，顺着血管弯曲的走向分别加入1000μl Trizol，快速冲洗三次，流出物分装入2个1.5ml无菌离心管中。放冰上。 

*胸、腹主动脉：隔肌以上为胸主动脉，隔肌以下为腹主动脉。分别用3ml冷PBS冲洗3次，去掉血块。分别加入1500μl Trizol，快速冲洗二次，流出物分装入2个1.5ml无菌离心管中。放冰上。 

*髂动脉：从腹主动脉与髂动脉分叉处向上0.5cm处剪断。用2ml冷PBS冲洗3次，去掉血块。加入1000μl Trizol，快速冲洗二次，流出物分装入2个1.5ml无菌离心管中。放冰上。