[发明专利]一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法。 

背景技术

配位聚合物（Coordination polymer）通常是指金属离子和有机配体通过自组装而形成的具有周期性网络结构的金属有机材料。例如，巯基配体-SR，氨基酸，氨基配体和金属离子M（M：Cu,Ag,Au等过度金属离子）可以通过有序自组装形成配位聚合物。结构通式如下： 

目前，酶活性的检测方法主要有比色法，荧光法，电化学方法等多种方法。传统的比色方法测定酶活性，检测方便，用肉眼即能分辨，但是检测的灵敏度比较低，易出现假阳性信号，不利于酶活性的检测。以H₂O₂为介体的检测酶活性的化学发光法和荧光方法通常需要两个或更多的化学反应过程，或在检测过程中加入其他的酶，使得这些方法非常复杂，价格昂贵而且耗时长，灵敏度低。 

荧光检测酶活性是目前酶活性检测的普遍使用方法。但是对于这些方法而言都存在一定问题。例如，以共轭聚合物为基础的荧光共振能量转移法检测乙酰胆碱酯酶活性(Continuous Fluorometric Assays for Acetylcholinesterase Activity andInhibition with Conjugated Polyelectrolytes.Angew.Chem.Int.Ed.，2007,46,7882-7886)。该方法运用带猝灭基团dabcyl的乙酰胆碱酯酶底物。没有乙酰胆碱酯酶存在时，可以和共轭聚合物PFP-SO₃^-通过静电相互作用，使共轭聚合物的荧光产生荧光共振能量转移荧光发生猝灭。加入乙酰胆碱酯酶后，ACh-dabcyl被水解，猝灭基团和胆碱底物分离，此时猝灭基团和PFP-SO₃^-带相同电荷，不发生荧光共振能量转移，所以荧光增强，从而定量检测乙酰胆碱酯酶的活性。这种方 法的检测限是0.05U/mL,灵敏度差，共轭聚合物的合成难度较高，而且需要额外标记猝灭基团，方法复杂，成本高。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的酶活性检测方法灵敏度比较低、易出现假阳性信号、方法复杂、价格昂贵和耗时长的问题，而提供一种羧酸酯酶的活性和羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下： 

本发明提供一种羧酸酯酶的活性的检测方法，具体步骤如下： 

步骤一：将底物分子和不同浓度羧酸酯酶反应，得到水解产物； 

步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶的活性进行荧光检测。 

优选的是，所述的羧酸酯酶为胆碱酯酶或脂肪酶。 

优选的是，所述的底物分子为硫代乙酰胆碱。 

优选的是，所述的步骤一中水解反应体系为：400μL总体系,包括浓度为6.875mM pH值为7.4的Tris-HAc缓冲溶液，浓度为0.06875mM底物分子，0-0.0004U/μL的羧酸酯酶，余量为无菌水。 

优选的是，所述的聚阴离子为聚乙烯磺酸钠或单链DNA。 

优选的是，带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝（3,4,9,10-tetra-(4-trimethylammoniobutyloxy-carbonyl)-perylene），其结构式为： 

优选的是，所述的检测体系为：550μL总体系,包括400μL水解反应体系，浓度为100μM重金属盐，浓度为60μM聚阴离子，浓度为10μM小分子探针，余量为无菌水。 

优选的是，所述的重金属盐为硝酸银或硝酸铜。 

优选的是，所述的荧光检测条件为：442nm荧光激发，460-650nm荧光检测。 

本发明还提供一种羧酸酯酶抑制剂的活性的检测方法，具体步骤如下： 

步骤一：将不同浓度的羧酸酯酶抑制剂和羧酸酯酶混合，再和底物分子反应，得到水解产物； 

步骤二：将步骤一得到的水解产物、重金属盐溶液、聚阴离子溶液和带正电荷的小分子探针溶液混合，对羧酸酯酶抑制剂的活性进行荧光检测。 

优选的是，带正电荷的小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝，其结构式为： 

发明原理