[发明专利]碱性红G检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种碱性红G检测试剂盒，其特征在于，主要包括：

1）包被碱性红G特异性抗原的酶标板：所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2）碱性红G特异性抗体溶液：该碱性红G特异性抗体的浓度为1-3μg/mL；

所述碱性红G特异性抗原与碱性红G特异性抗体溶液的用量比为1：1。

2.根据权利要求1所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。

3.根据权利要求1或2所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，所述碱性红G特异性抗原的浓度为2μg/mL；所述碱性红G特异性抗体的浓度为2μg/mL。

4.根据权利要求1所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，还包括碱性红G标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。

5.根据权利要求4所述的碱性红G检测试剂盒，其特征在于，所述碱性红G特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗原为碱性红G与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述碱性红G标准品溶液浓度分别为1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L；所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0.05%-0.5%吐温-20的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。

6.一种碱性红G检测试剂盒制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1）制备包被碱性红G特异性抗原的酶标板：将碱性红G分散于0.01mol/L盐酸中，搅拌，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将上述碱性红G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，搅拌，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌，偶联制备得到碱性红G特异性抗原；将碱性红G特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内碱性红G特异性抗原的浓度为1-3μg/mL；

2）制备碱性红G特异性抗体：以步骤1）中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体；所述碱性红G特异性抗体的浓度为1-3μg/mL。

7.根据权利要求6所述的碱性红G检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤1）中，制备碱性红G特异性抗原的具体方法为：将0.88g碱性红G分散于50mL的0.01mol/L盐酸中，55℃搅拌2h，碱性红G的酯基被水解形成羧基；将0.82g的上述碱性红G羧酸衍生物、1.2g N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2.1g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65℃搅拌1h，反应产物进行柱层析纯化得到中间产物；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸中，回流搅拌1h，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的碱性红G的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合，再与牛血清白蛋白混合，室温搅拌1h，偶联制备得到碱性红G特异性抗原。

8.根据权利要求6所述的碱性红G检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤2）为：以步骤1）中合成的碱性红G特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0.35mg/mL，剂量为110μg/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与碱性红G特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫5-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐剂直接用碱性红G特异性抗原水溶液腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0.5mL/只；将细胞浓度为1.4万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0.5mL/只；接种杂交瘤细胞7~10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4℃冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的碱性红G单克隆抗体。