[发明专利]滇池金线鲃精子超低温冷冻保存及复苏方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种滇池金线鲃精子超低温冷冻保存及复苏方法，属于低温生物学技术领域。

背景技术：

Sinocyclocheilus grahami（Regan，1904）又名滇池金线鱼、波萝鱼、小洞鱼，隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）金线鲃属（Sinocyclocheilus）。滇池金线鲃是滇池流域的特有种，分布于滇池及其流域所在河流、溶洞、暗河之中。滇池金线鲃肉质鲜美，系云南“四大名鱼”之首，1989年，被列为国家II级保护动物，在《中国濒危动物红皮书(鱼类)》中被列为濒危等级，在中国物种红色名录中被列为VU等级。自上世纪50年代后期以来，由于外来种入侵、水体污染、生境丧失、过度捕捞等原因，滇池金线鲃在滇池湖体已经消失，现仅存于入湖溪流及龙潭中。若不及时采取有效拯救措施，以后将在自然界中将很难找到滇池金线鲃这一物种；尽管滇池金线鲃人工繁殖已成功，但由于养殖鱼类本身的局限性，在人工繁殖中，容易造成雌雄性腺发育不同步；并且在长期的塘养环境下，容易造成种质退化，遗传多样性减少、生长速度缓慢、品质下降、对病害和环境胁迫的防御能力降低，病害发生日趋严重，因此对其进行精子冷冻保存技术的研究对于滇池金线鲃优良品种的种质保存及遗传多样性保护具有重要意义。

经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能够简便、高效、长期保存滇池金线鲃精子的超低温冷冻及复苏方法。

本发明的滇池金线鲃精子的超低温冷冻及复苏方法，其具体步骤如下：

a.配子的采集：采精方法为轻压腹部法，选择形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的亲鱼原种或良种，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL离心管中；

b.鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻；     

c.冷冻方法：将精液与抗冻液按1:2的体积比稀释后分装，经4℃平衡60 min，然后在液氮面上方6 cm处平衡2 min，液氮面上平衡2 min后投入液氮中保存；其中：抗冻液为稀释液D-15+7.5%乙二醇；

d. 复苏方法是将冻存管从液氮中取出后置于37℃水浴锅中快速晃动20 s。

使用时，将滇池金线鲃鱼卵挤入容器中，按10⁵:1的精卵数量比加入解冻后的精液，拌匀，再滴加0.2 ml激活液，搅拌，使卵受精。

本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。

本发明具有成本低，操作简便，保存时间长，复苏后精子的活力较高，人工繁殖的滇池金线鲃鱼的受精率和孵化率较高，能投入规模生产的优点；对于开展鱼类资源恢复与重建也具有重要意义。

具体实施方式：

发明人分别于2011年1月~4月和2012年1月~4月在中国科学院昆明动物研究所珍稀土著鱼类保育研究基地，采用本发明方法超低温冷冻了80尾滇池金线鲃精液，经检测，解冻后精子活力平均为59.3%。滇池金线鲃精子超低温冷冻保存方法的如下：

亲鱼的选择：形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的原种或良种。

配子的采集：100 ppm的MS-222 (Tricaine，C₁₀H₁₅NO₃S)麻醉5 min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL离心管中。

鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻。

冷冻方法：将精液与抗冻液（D-15+7.5%乙二醇）按1:2的体积比稀释后分装，经4℃平衡60min，然后在液氮面上方6cm处平衡2min，液氮面上平衡2min后投入液氮中保存。

复苏方法：将冻存管从液氮中取出后置于37℃水浴锅中快速晃动20 s。

冻精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力。

2012年3月12日复苏2011年2月21日超低温冷冻保存的10尾滇池金线鲃精液，采用人工授精的方法，按10⁵：1的精卵数量比例进行人工授精，获得受精卵48715粒，受精率平均为52.9%，多细胞期、神经胚期和体节期的胚胎存活率分别为90.8%、66.0%和46.8%，孵化率为35.3%；2012年3月19日完成鱼苗孵化，孵出鱼苗9097尾。