[发明专利]具有牛TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种具有TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法。

背景技术

真核生物的天然免疫是抵抗外界病原体入侵的第一道防线，主要通过模式识别受体来识别外来的病原体，随即引发一系列信号传导、细胞因子活化、激活免疫系统，在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。Toll样受体(Toll Like Receptors，TLRs)是近年来研究和发现的识别入侵机体病原体的模式受体之一。TLRs能够最先接触入侵的病原体，通过识别位于病原体表面的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，TLRs可激活、引发一系列趋化因子和促炎性细胞因子的转录和分泌，如提高白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素1β(IL-1β)等细胞因子的表达水平，调动炎症反应所需的多种炎性细胞和炎性分子，对入侵的病原体进行清除，发挥机体天然免疫的重要防御作用。有关人、鼠、牛等不同物种的TLRs研究已证实，TLRs基因的遗传变异和修饰会影响机体对感染性疾病的易感性，并影响疾病的发生和发展。所以，TLRs一经发现，就以其重要而独特的生物学功能和潜在的应用前景迅速成为免疫学、遗传学等研究的热点。不同的TLRs家族成员能特异地识别不同类型的病原体，Toll样受体4(TLR4)可以特异性地识别革兰氏阴性菌独特的结构成分-脂多糖(LPS)。

革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌是引起奶牛乳房炎发病的主要病原菌之一。只有当入侵的病原微生物被及时有效地清除，才能使病原微生物所引起的炎症反应对乳腺组织结构和功能的损害降到最低。其中任何一个环节的功能障碍都会干扰乳房正常的炎症反应，造成不同程度的乳房炎症。在这一过程中，奶牛乳腺组织中的乳腺上皮细胞和巨噬细胞的TLR4负责识别革兰氏阴性菌并激活机体相应的免疫应答反应。事实上，TLR4对革兰氏阴性菌识别的敏感程度及诱发机体免疫反应的快慢决定了奶牛乳房炎的发病程度。研究也表明，TLR4基因的突变会影响奶牛乳房炎的发病率。因此TLR4被认为是抵御奶牛乳房感染的重要候选功能基因之一而备受关注。

在体外细胞水平对TLR4基因功能及其在奶牛乳房抗感染免疫的作用展开研究，不仅可以排除奶牛个体作为模型时的复杂性、减少许多环境的干扰因素，而且保证了基因功能的研究尽可能地在相同的遗传背景下进行，从而获得比较准确客观的体外研究结果。这样既有助于理解TLR4基因的作用机理，又能为在个体水平进行基因功能的深入研究提供可借鉴的实验依据和参考。与人、小鼠相比，用于研究牛TLR4基因功能相应的商品化细胞模型缺乏，一定程度上制约了这一领域的研究。到现在为止，尚没有商品化的牛乳腺上皮细胞系，加之原代乳腺上皮细胞培养条件苛刻，经传代后，细胞极易老化而丧失其乳腺细胞的特性。获得可用来研究TLR4基因功能的细胞模型，能够克服由于缺乏合适的抗体、基因敲除模型和现成的细胞模型造成的牛TLR4功能研究手段十分有限的技术难题。

HEK293细胞是人胚胎肾细胞，常常用来研究基因功能的商品化细胞系，而HEK293细胞本身不表达TLR4、CD12和MD2，不能被LPS激活产生相应的细胞因子。因此，HEK293不能直接用来进行TLR4功能研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及具有TLR4免疫应答功能的细胞模型，其特征在于将牛源MD2、CD14、TLR4不同的三个基因用2A序列连接、组装到载体上，将载体导入商品化细胞系中，构建的细胞模型具有LPS介导的免疫应答功能。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的商品化细胞系是HEK293。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体是pLEX-MCS载体。

本发明另一方面还涉及上述细胞模型的构建方法，其特征在于包括扩增MD2、CD14、TLR4序列，然后将所扩增的序列组装到载体上，并将载体导入到商品化细胞系中，选择同时表达MD2、CD14、TLR4三个蛋白的阳性细胞系。