[发明专利]检测维生素B12的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测维生素B12的酶联免疫试剂盒，其适用于谷物类（玉米面、黄豆面、小米面、大米面）、牛奶、奶粉中维生素B12的测定。

技术背景

维生素是各种生物维持正常生理功能所必需的一类低分子有机化合物，它们大多数是生化代谢过程中的主要辅酶，在体内参与、调节、控制许多合成和分解代谢，当生物体缺乏维生素时，就会引发物质代谢障碍，引起多种疾病。维生素B12又叫钴胺素，其主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。维生素B12对于促进畜禽生长特别是在促进幼畜生长发育方面效果显著，在畜禽体内主要以参与一碳单位和丙酸代谢发挥作用，影响遗传物质的合成，还能维持神经功能的完整性，是畜禽不可缺少的营养原料。养殖生产过程中，常规饲料中的维生素B12一般作为安全用量，额外添加适量维生素B12可以提高畜禽生产性能，带来可观的经济效益。

近年来，余林梁等报道了以HPLC测定维生素H，邓富良等用HPLC同时测定注射用水溶性维生素中维生素H和叶酸，任一平、龙朝阳等以HPLC测定食品中的叶酸，杨谊等以HPLC测定维生素B12。隋玉荣等用离子对色谱法测定了维生素B12及叶酸的含量，H. B.Li、Heudi用不同波长同时测定了维生素H、叶酸和维生素B12，宋金春等通过优化色谱条件，建立了同一波长条件下HPLC同时测定注射用水溶性维生素中维生素H、叶酸及维生素B12含量的方法。另外维生素B12的测定方法主要有比色法、电化学分析法、离子交换法、激光共振拉曼光谱法等，这些方法均是先测定样品中 Co 含量，由钴含量换算成VB12的含量，操作繁琐，选择性较差。刘保生等建立了利用AO-R6G 能量转移荧光猝灭法测定维生素B12的新方法。免疫学检测方法也应用于维生素B12的检测中，采用间接竞争ELISA方法测定维生素B12含量的方法，简便、快速、灵敏度高，稳定性好，能满足维生素B12的现场大批量样品的快速筛选。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于维生素B12含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

（1）包被有维生素B12偶联抗原的酶标板；

（2）维生素B12特异性抗体；

（3）酶标记抗抗体；

（4）维生素B12标准品溶液；

（5）底物显色液；

（6）终止液；

（7）浓缩洗涤液；

（8）复溶液。

所述维生素B12偶联抗原为维生素B12半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述维生素B12半抗原的结构如下：

。

所述维生素B12半抗原制备过程：0.50g维生素B12、0.10g琥珀酸酐和1ml吡啶在20ml DMSO中的混合液，在80℃下搅拌反应40小时，蒸除溶剂，乙醇-水体系多次重结晶后得到邻苯二甲酸单维生素B12酯，为维生素B12半抗原。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述维生素B12特异性抗体为维生素B12单克隆抗体，是用维生素B12偶联抗原为免疫原免疫动物得到的；所述维生素B12特异性抗体可为鼠源、马源、羊源或兔源抗体，所述维生素B12单克隆抗体优选为维生素B12鼠单克隆抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括维生素B12标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。

所述的终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸溶液，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，底物液A液为过氧化脲溶液，底物液B液为四甲基联苯胺溶液。

所述浓缩洗涤液为pH7.2~7.6，含0.5%~1.0%吐温-20和0.01‰~0.05‰的叠氮化钠防腐剂的0.1~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

所述的复溶液为pH值为7.0~7.2，含有5%~10%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.0~9.6，0.1~0.2mol/L碳酸盐缓冲液，所用封闭液为pH7.2~7.6，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量百分比。