[发明专利]一种烟蚜hunchback基因cDNA及其应用

权利要求书

1.一种Mphb基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种Mphb基因表达的蛋白，其特征在于，其由权利要求1所述的cDNA所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述cDNA的克隆方法，包括以下步骤：

（1）从烟蚜成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；

（2）设计简并引物，所述简并引物正向序列如SEQ ID NO.3所示，反向序列如SEQ ID NO.4所示；

（3）以步骤（1）得到的cDNA为模板，用步骤（2）所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段；

（4）纯化步骤（3）得到的PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞，筛选含目的片段的阳性克隆；

（5）将步骤（4）所得的阳性克隆进行序列测定，得到权利要求1所述的cDNA。

4.一种如权利要求1所述cDNA的应用，其特征在于：从权利要求1所述的cDNA序列中选取SEQ ID NO.1中第303-729位的427bp作为干涉靶标，构建合成Mphb dsRNA的植物表达载体，通过根癌农杆菌介导转化获得表达Mphb dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因植物，烟蚜取食所述转基因植物后，烟蚜的Mphb表达受抑制，烟蚜胚胎发育受阻，繁殖能力下降。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草，果树，十字花科蔬菜，瓜类或茄类。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：获得表达Mphb dsRNA的能抑制烟蚜繁殖的转基因烟草的方法步骤如下：

（1）MphbcDNA片段靶标序列的扩增与酶切位点的引入：设计引物，扩增MphbcDNA片段427bp靶标序列，在上下游分别引入SalⅠ与BamHⅠ位点，所述引物正向序列如SEQ ID NO.5所示，反向序列如SEQ ID NO.6所示；

（2）纯化步骤（1）所得PCR产物，回收目的片段，取纯化产物连接到pMD18-T载体上得到pMD18-T-Mphbi，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，选含pMD18-T-Mphbi的阳性克隆子，培养阳性克隆子，从中提取pMD18-T-Mphbi质粒；

(3) pMD18-T-Mphbi酶切以获得靶标片段，酶切结束后，回收Mphb靶标片段；

（4）pUCCRNAi反向连接位点的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi反向连接片段；

（5）pUCCRNAi反向连接片段与Mphb靶标片段连接得到pUCCRNAi-Mphb-R，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10，筛选含pUCCRNAi-Mphb-R的阳性克隆子；

（6）pUCCRNAi-Mphb-R正向连接位点的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi-Mphb-R大片段；    

（8）pUCCRNAi-Mphb-R大片段与Mphb靶标片段连接得到pUCCRNAi-Mphb-F-R，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10，筛选含pUCCRNAi-Mphb-F-R的阳性克隆子；

（9）pUCCRNAi-Mphb-F-R dsRNA表达框Mphb-F-R的酶切，酶切结束后，回收pUCCRNAi-Mphb-F-R dsRNA表达框片段Mphb-F-R；

（10）pCAMBIA2300的酶切，酶切结束后，回收pCAMBIA2300大片段；

（11）pCAMBIA2300大片段与Mphb dsRNA表达框片段Mphb-F-R的连接得到植物表达载体pCAMBIA2300-Mphbi，取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10，筛选含pCAMBIA2300-Mphbi的阳性克隆子；提取质粒pCAMBIA2300-Mphbi，通过酶切与测序，确认载体构建正确；

（12）植物表达载体pCAMBIA2300-Mphbi转化根癌农杆菌；

（13）转基因烟草的获得：

采用叶盘转化法获得转基因烟草植株，将步骤（12）含有植物表达载体pCAMBIA2300-Mphbi的农杆菌接种于YEB培养基培养至OD₆₀₀=0.6～1.0，浸染烟草叶盘，然后将叶盘转移到共培养基进行暗培养，再将叶盘转移到分化培养基光照培养25-35天，保持28～30℃，分化出小苗后，将苗转移到生根培养基进行培养，生根后将苗移栽到土壤，繁殖到T₂代。