[发明专利]一株具有百草枯抗性的硝化还原假单胞杆菌的应用无效
| 申请号： | 201210256939.5 | 申请日： | 2012-07-23 |
| 公开（公告）号： | CN102807963A | 公开（公告）日： | 2012-12-05 |
| 发明（设计）人： | 郭书巧;倪万潮;束红梅;巩元勇;沈新莲;张香桂;徐鹏 | 申请（专利权）人： | 江苏省农业科学院 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/31;C12N15/82;A01H5/00 |
| 代理公司： | 南京知识律师事务所 32207 | 代理人： | 卢亚丽 |
| 地址： | 210014 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 具有 百草 抗性 硝化 还原 假单胞 杆菌 应用 | ||
1.硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitrored-cens）CGMCC6300在提高大肠杆菌对百草枯的抗性中的应用。
2.硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitroredcens）CGMCC6300在制备具有百草枯抗性的转基因烟草中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，具体步骤是如下：
（1）从硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitroreducens）CGMCC6300中分离百草枯抗性基因PnPQR：
以P1：5'-CCACTCCGATGTCCAATC-3′和P2：5'-TTACCCGCTCGTCCCTAT-3′为引物，通过PCR从硝化还原假单胞杆菌（Pseudomonas nitroredu-cens）CGMCC6300中分离序列如SEQ ID NO.1所示的目标基因PnPQR，将PnPQR连接到pMD18-T载体中，构成pMD-PnPQR载体；
（2）pCAMBIA2301载体启动子和终止子的添加
以pBI121为模板，应用引物35SF：5'-GAATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3′和35SR：5'-GAGCTCAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG-3′，扩增CaM35S启动子片段；用EcoRⅠ和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301同时进行双酶切，用T4ligase连接成pCAMBIA2301-35S；再以pBI121为模板，用引物NOSF：5'-GCATGCATCGTTCAAACATTTGGCAATAA-3'和NOSR：5'-GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3′，扩增NOS终止子片段，再用SphⅠ和HindⅢ对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-NOS同时进行双酶切，用T4ligase连接成pCAMBIA2301-35S-NOS；
（3）pCAMBIA2301-PnPQR植物表达载体的构建
以pMD-PnPQR为模板P3：5'-GAAGGATCCTCCACTCCG ATGTCCAATC-3′和P4：5'-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3'为引物，扩增包括PnPQR编码区全长片段，用BamHI和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-NOS载体同时进行双酶切，用T4ligase连接成pCAMBIA2301-PnPQR；
（4）植物表达载体pCAMBIA2301-PnPQR通过农杆菌介导转化烟草，获得转基因烟草。
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