[发明专利]一种检测NPM蛋白的试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学发光免疫分析技术领域，特别涉及一种检测NPM蛋白的试剂盒及其制备方法，结合了生物素一亲和素免疫放大技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核质和胞质之间，参与核糖体前体运输和合成及中心体的复制，进而调控细胞的周期进程和增殖发育。NPM蛋白表达于增殖活跃的细胞包括肿瘤细胞和干细胞，在肿瘤形成过程中发挥重要作用。实体肿瘤细胞往往表达NPM基因，产生核仁磷酸蛋白。在科研和生产过程中，需要测定溶液中NPM蛋白含量变化，来监控实验条件和监控生产过程。

目前NPM蛋白测定方法有胶体金免疫层析(GICA)；蛋白质印迹(WB)；酶联免疫吸附试验(ELISA)，化学发光法免疫分析(CLIA)；GICA、ELISA、WB的优点是相对成本低廉，缺点是灵敏度低，NPM蛋白含量少的情况下检测不出，CLIA检测灵敏度比上述方法高，但还是不能满足科研上对NPM蛋白超微量检测的需要。为了适应科研和生产上对检测灵敏度的更高要求，需要对化学发光技术进行创新。

1977年，Halmann将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法(CLIA)。经过几十年的发展。目前根据标记物的不同，化学发光免疫分析可分以下四个类型：(1)以辣根过氧化物酶(HRP)为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为鲁米诺及其衍生物，在氧化剂存在下，HRP催化鲁米诺及其衍生物发光，波长425nm。苯酚类化合物可增强其发光强度；(2)以碱性磷酸酶为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为1，2一二氧环乙烷衍生物(或称金刚烷衍生物)。例如AMPPD，CSPD，CDP-Star，Lumi-phos480，Lumiphos-530等。表面活性剂会增强并延长其发光强度，发光波长470nm；(3)以吖啶酯类为标记物的化学发光系统。该系统采用直接标记吖啶酯类发光剂，吖啶酯类发光剂在碱性H₂O₂作用下直接发光，波长430nm处吖啶酯类发光系统发光强度高；(4)以三联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺为标记物的电化学发光系统。是通过施加一定的电压进行电化学反应，在电极表面产生电生物质，然后电生物质与体系中三丙胺(TPA)之间通过电子传递形成激发态，之后激发态的能量以光的形式释放出来.在波长350～420nm处发光强度高。

1982年，Ikarlyama等以氯化血红素代替辣根过氧化酶(HRP)，用碳二亚胺法将其标记在人体血清白蛋白(HSA)上，结合酶免疫分析技术，对HSA的化学发光免疫测试进行了初步探讨。他们这一开创性的研究，为金属卟啉在酶免疫分析中的应用奠定了基础。

1984年，Hara等将铁卟啉配合物标记于HSA抗体上用于检测HSA，并将这一体系应用于分析化学中。

1992年，Adam等对铁卟啉和锰卟啉的催化机理进行的研究，并与辣根过氧化酶的催化发光效应进行了比较。

1993年，Motsenbocker等用光敏剂和金属卟啉标记抗体进行免疫检测。

1994年，慈云祥等课题组对于金属卟啉催化剂替代辣根过氧化酶催化化学发光反应也进行了一些探索。

2006年，Komagoe等卟啉诱导的光学生成过氧化氢的测定，用鲁米诺发光法：在水溶液中与卟啉聚集的一个结构活性关系进行研究。

2006年，Rana等电化学产生过氧化氢和卟啉化学发光法进行了尝试。

2006年，李春艳等四苯基卟啉锌掺杂8-羟基喹啉铝与四苯基联苯二胺的电致发光性能进行了研究。

2007年，刘波等发光材料四苯基卟啉及其金属配合物的合成及性能进行了研究。

2008年，吴俊等卟啉掺杂MEH-PPV的发光性能进行了探讨。

2011年，D Wu等新型化学发光流动注射分析减少其对鲁米诺-间-四(3-甲氧基-4-羟基)苯基卟啉锰催化过氧化氢的反应进行了研究。

2012年，Kazemi等对动力学化学发光锰(III)-四(4-磺酸)卟啉鲁米诺过氧化氢体系的人和牛血清白蛋白的影响进行了研究探索。