[发明专利]一种检测NPM蛋白的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测NPM蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)NPM蛋白校准品；

2)链亲和素偶联的固相载体；

3)生物素化的NPM蛋白配体；

4)5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的NPM蛋白配体；以及

5)上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化学发光底物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NPM蛋白为核仁磷酸蛋白。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NPM蛋白校准品为核仁磷酸蛋白配制的校准品冻干品，校准品内所用的保护基质蛋白为牛血清白蛋白，卵清蛋白。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链亲和素偶联的固相载体为磁性颗粒，塑料颗粒。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NPM蛋白配体为可以与NPM蛋白特异性结合反应的单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、蛋白质、大分子有机化合物。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉结构式如(Ⅰ)所示：

(Ⅰ)

结构式(Ⅰ)中R为n为1～4的自然数。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的NPM蛋白配体所用的偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉所作用的化学发光底物为吖啶酯、吖啶磺酰胺。

9.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以NPM蛋白纯品配制NPM蛋白校准品；

2)使链亲和素偶联固相载体；

3)使NPM蛋白配体生物素化；

4)用5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记NPM蛋白配体；

5)配制化学发光底物液；

6)分装上述NPM蛋白校准品、链亲和素偶联固相载体、生物素化的NPM蛋白配体、5，10，15-三(4-吡啶基)-20-R-羧基卟啉偶联标记的NPM蛋白配体和化学发光底物液；以及

7)组装为成品。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备NPM蛋白校准品的步骤1)采用以下方法：

配制含牛血清白蛋白2％，卵清蛋白1.5％，水解明胶0.5％，2.5％蔗糖的0.01M PB缓冲溶液为校准品基质液，用基质液配制含不同浓度NPM蛋白的校准品，用西林瓶分装1mL/瓶，冻干处理后，-20℃保存。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备链亲和素化固相载体的步骤2)采用以下磁性颗粒方法：

250mg氨基末端磁性颗粒置于烧杯，加入甲醇及丙酮各5mL反复清洗，磁性分离，弃去上清，加入DMF溶解的10mL0.2％的1，4一苯二异硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒温振荡器，反应10h，最后将反应后的磁性颗粒用丙酮及超纯水反复清洗6遍，取新制备经PDITC活化的磁性颗粒置于30mL离心管中，加入PBS25mL，加入4mg链亲和素，置于恒温振荡器中反应20min，磁性分离，测定反应前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20℃保存。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备链亲和素化固相载体的步骤2)采用以下塑料颗粒方法：

250mg氨基末端塑料颗粒置于烧杯，加入甲醇及丙酮各5mL反复清洗，离心分离，弃去上清，加入DMF溶解的10mL0.2％的1，4一苯二异硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒温振荡器，反应10h，最后将反应后的塑料颗粒用丙酮及超纯水反复清洗6遍，取新制备经PDITC活化的塑料颗粒置于30mL离心管中，加入PBS25mL，加入4mg链亲和素，置于恒温振荡器中反应20min，离心分离，测定反应前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20℃保存。