[发明专利]一种T-2毒素的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医药理学领域和天然药物化学领域，具体涉及一种T-2毒素的生物合成方法。

背景技术

T-2毒素（Ⅰ），化学名4β-15-双乙酰基-8α-(3-甲基丁酰氧基)-3α-羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯。分子式C₂₄H₃₄O₉，分子量为466.22，是镰刀菌毒素中单端孢霉烯族A族代表毒素，也是镰刀菌毒素中毒性最强的一种毒素。T-2毒素有着许多的致病作用如导致皮肤过敏、出血综合症、败血症（Wyatt,et al.,1972;Yagen,et al.,1976）、造血功能抑制、腹泻、呕吐、免疫抑制和致畸致突变作用（Sydenhame et al.,1991;Desjardins et al.,1993）。

由于存在着潜在致癌性以及在全世界广泛分布，各国学者对T-2毒素的毒性和代谢研究由来已久。T-2毒素的制备研究有着深远的意义，镰刀菌毒素发生、污染和产毒机制研究为防控镰刀菌的污染提供可靠的资料，也为其毒性、代谢、残留检测研究源源不断地提供了宝贵的原料。但T-2毒素结构复杂难以化学合成，因此T-2毒素的制备通常采用生物合成方法。

目前国际上现存的合成路线只有一种，即通过生物发酵来合成T-2毒素。生物合成是以产毒镰刀菌毒素污染谷物的条件为基础，较为精确控制培养条件，找到最适产毒条件并在此条件下培养产毒的方法。原理是通过人工感染谷物，培养霉变谷物后进行分离纯化出毒素纯品。然而传统提取工艺流程太过繁琐，仅柱层析多达3步甚至更甚，并不能有效的解决分离步骤繁琐的问题。由于传统制备分离步骤复杂繁琐且规模小，因而毒素极难获得并价格高昂。给各国学者深入研究带来了不便，一些对毒素毒性和代谢研究意义重大并提供重要科研数据的研究如传统毒理学研究和体内代谢研究受原料限制而难以全面开展和完善。当前需要一种经济高效便捷的提取工艺，为科研工作者研究T-2毒素毒性、代谢等一系列相关研究提供原料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种T-2毒素的生物合成合成方法，本发明方法生产的T-2毒素可以作为标准品使用，有效解决了合成工艺路线长、收率低、成本高、处理繁琐复杂、试剂毒性强、环境污染严重、不易于分离的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明利用生物发酵法生产T-2毒素，采用拟分枝孢镰刀菌（Fusarium graminearum Sherbakoff），经菌种复苏、分生孢子液制备、控制培养温度发酵、萃取、一步柱层析和结晶来生物合成T-2毒素。具体步骤如下所述：

（1）菌种复苏和分生孢子悬液的制备：菌种（菌种购自美国标准菌种保存中心ATCC，编号24631）加入蒸馏水复水过夜后接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基（或称PDA培养基），在15-30℃下培养4-8天；取培养4-8天的PDA培养基，挑取菌丝至分生孢子悬液培养基（或称CMC培养基），光照下15-30℃，200rpm摇床培养7-9天；

（2）玉米产毒培养：将摇床培养7-9天后的分生孢子液，接种至已经121℃30分钟，每天一次，灭菌两次后的玉米产毒培养基中，接种后放入15-30℃黑暗培养，培养时每隔1天震荡培养基至玉米颗粒松散无大结块；

（3）T-2毒素的提取分离：向培养15-28天的玉米产毒培养基中按体积重量比15mL/g加入50%-70%乙醇水溶液，并搅拌均匀，浸泡静置1-3天；将浸泡后的乙醇液采用中速定性滤纸抽滤，收集乙醇液。每1L乙醇提取液在旋转蒸发仪上40-60℃下旋转至100mL-300mL左右，收集浑浊水相，按水相:二氯甲烷2:1（v/v）比例加入二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷萃取液后，30-35℃下旋转蒸干，收集棕褐色色油状粗毒素；每10g粗毒素用50-200mL二氯甲烷溶解后按粗毒素:硅胶重量比1:40比例上样至顶部，采用石油醚丙酮体积比4:1作为洗脱液来进行洗脱，每隔30mL收集，并采用T-2毒素化学对照品进行对照，收集含有T-2毒素单一染色点部分，收集液在旋转蒸发仪下40-60℃下旋转蒸干；向将蒸干后的T-2毒素逐步加入分析纯丙酮并不断振荡至T-2毒素溶解，再加入分析纯正己烷至白色浑浊后，滴加丙酮至再次澄清透明，静置过夜，待白色晶析出，收集放入真空干燥器干燥，即获得纯度不低于95.6%的T-2毒素结晶；

本发明的创新性和优点：