[发明专利]一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法。

技术背景

肝素（普通肝素即未分级肝素），是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血作用，其分子量范围为3000~30000 Da。在临床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环等。肝素的抗凝血活性分为抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性两大类。其最大的副作用是引起出血，有时甚至会导致出血性死亡，因此，为了解决其出血的问题，人们研制了新型的抗凝血药物——低分子肝素。这类药物是普通肝素的一种升级产品，具有链短、结合部位少、生物利用度高、半衰期长等优点。在抗血栓形成的过程中，抗FXa活性与抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓作用的衡量标准用抗FXa／FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越强，出血倾向越小。当皮下注射低分子肝素时，其在体内的抗FXa作用要比普通肝素强得多，而抗FIIa活性较弱，还具有体内半衰期延长、生物利用度高等优点，目前已逐渐取代肝素成为主流的抗血栓类的药物。

由于低分子肝素在未分级肝素中的含量较低，目前市场上低分子肝素都是由未分级肝素经化学降解或酶降解方法制备的钠盐或钙盐。其平均分子量约为5000 Da分子量分布为3000~8000 Da。在降解的过程中，部分戊糖抗凝血活性中心被破坏，只有约20％的组分具有戊糖活性中心。低分子量肝素与肝素相比，抗栓活性降低了约30％，抗凝活性则更低。降解后所制备的低分子肝素与天然低分子肝素相比，除了效价偏低以外，还会有杂质过多、质量难以控制以及结构不稳定等缺点。目前还无法人工合成在效果和结构上能与天然低分子肝素想媲美的产品。另外，在肝素制备的过程中，为了获得更高的效价，往往采取低倍乙醇分级沉淀的方式除去天然低分子肝素，因此会有大量的天然低分子肝素溶解于乙醇中。平均每生产1 kg普通肝素所消耗的医用乙醇约为100 kg，而这些醇沉液最终被排放至乙醇回收塔中，再乙醇回收完毕以后最终被作为废液排放到自然界中。这种处理方法不仅会导致对环境造成极大的污染，而且会导致天然低分子肝素资源的极大的浪费。目前还缺少对这类废液最合适的处理方法。

随着技术的进步和加工工艺的发展，各种膜材料逐渐用于生物分离工艺，从而使原本复杂的分离工艺变得简单易行。与传统分离方法相比，膜分离方法具有效率高、工作条件温和、可连续操作等优点，因此在工业上得到了越来越广泛的应用。超滤技术是利用膜的选择性透过原理，将大分子截留于膜上而允许小分子物质透过。在传统的超滤过程中随着超滤的进行，由于浓差极化现象而使大分子物质在膜介质表面不断堆积，造成超滤膜的通量大大降低，影响分离效率，因此在实际应用中常采用错流过滤或切向流过滤来提高超滤效率。在切向流超滤技术中，原料液的流向平行于超滤膜，从而可以及时将沉积在超滤膜表面的大分子溶质随着料液的流动而转移，有效缓解膜通量下降过快的问题。通过滤液回流和重复超滤，可对滤液中溶质进行快速浓缩和分离。

 发明内容

本发明的目的就是根据上述现有技术的状况而提供一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法；该方法通过对肝素废液进行酶水解、碱氧纯化、滤膜过滤除杂后，再采用多膜分级切向超滤法，使用2000~10000 Da多种规格超滤膜作为手段，从预处理过的肝素废液中分离得到分子范围为3000~8000 Da的天然低分子肝素组分；分离成本低，分离效率高，所制备的低分子肝素是纯天然的产物，保持着天然的构象，无有机试剂残留。

本发明的一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法，包括以下步骤：

1）酶水解，除去小分子蛋白：取肝素废液，用NaOH溶液调整pH为9~11之间，在40~50℃加入胰蛋白水解酶搅拌15~24小时，然后将温度升至90~95℃保温2~3个小时，离心，弃去沉淀，向上清液中加入NaCl和乙醇，沉淀12~18小时，得沉淀物；其中胰蛋白水解酶及NaCl的用量按kg/L计，分别为肝素废液体积的0.1%和1%，乙醇的用量为上清液体积的2-3倍；

2）碱氧纯化，脱色：在步骤1）所得的沉淀物中加入其重量30~60倍的纯化水，搅拌溶解，得溶解液；控制溶解液温度为40℃~50℃，调整溶解液pH为9~11之间，加入溶解液体积0.1~0.5%的过氧化氢，室温搅拌反应6-8小时，得纯化液；

3）滤膜过滤除杂：将步骤2）所得的纯化液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，以除去溶液中悬浮的颗粒，得滤液；