[发明专利]扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求在韩国知识产权局于2011年7月11日提交的韩国专利申请No.10-2011-0068556和2012年5月10日提交的韩国专利申请No.10-2012-0049776的权益，它们的公开内容全部通过参考引入本文。

技术领域

本公开内容涉及扩增靶核酸的方法和测定样品中的靶核酸的相对量的方法。

背景技术

核酸扩增指靶核酸序列或其互补序列的拷贝数增加。核酸扩增是本领域中公知的。核酸扩增包括在扩增过程期间需要多个循环的方法或在单一温度下实施的方法。循环技术以需要热循环的方法例示。需要热循环的方法包括聚合酶链式反应(PCR)，其是本领域中公知的。PCR包括通过热变性将双链DNA变性成单链DNA，将引物与单链DNA退火；和由所述引物合成互补链。

等温扩增是在单一温度下实施的或者其中扩增过程的主要方面在单一温度下实施的扩增。在PCR过程中，加热反应产物以分开两条链，使得另一引物可结合到模板。相反地，等温技术依赖于链置换聚合酶(strand displacing polymerase)，以分开双链的两条链并再复制模板。等温技术可以分成依赖于引物置换以引发反复的模板复制的方法和依赖于单一引物分子的连续再使用或新合成的方法。依赖于引物置换的方法包括解旋酶依赖性扩增(HDA)、外切核酸酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)、和环介导的扩增(LAMP)。依赖于单一引物分子的连续再使用或新合成的方法包括链置换扩增(SDA)或基于核酸的扩增(NASBA和TMA)。

扩增偏倚(amplification bias)可以在扩增短的靶核酸时根据靶核酸的类型而产生。扩增偏倚可根据靶核酸拷贝数或碱基序列、例如AT含量或GC含量而变化。例如，在包含多种微RNA(miRNA)的样品中，即在包含miRNA文库的样品中扩增各miRNA时，扩增偏倚可根据miRNA的序列和miRNA的拷贝数而变化。通常，miRNA具有范围为约18至25nt且平均约21至24nt的长度，而且具有超过1000种类型的序列。

因此，仍需要开发在没有扩增偏倚的情况下或以降低的扩增偏倚扩增在包含多种靶核酸诸如miRNA文库的样品中的靶核酸的方法。

发明内容

提供以降低的扩增偏倚扩增靶核酸的方法。

提供测定样品中的靶核酸的相对量的方法。

附图说明

通过结合附图考虑的实施方案的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中：

图1A和1B显示扩增产物的电泳结果。

具体实施方式

现在将详细地介绍实施方案，其例子在附图中说明，其中相同的附图标记始终是指相同的元件。在这点上，本实施方案可以具有不同形式，并且不应解释为限于本文中所阐述的描述。因而，下文仅通过参考附图描述实施方案以解释本说明书的各方面。诸如“…至少一种(个)”的表述在要素列表之前或之后时修饰整个要素列表，而不是修饰该列表的单独要素。

根据本发明的实施方案，提供扩增靶核酸的方法，该方法包括：提供包含多种类型的靶核酸的样品；连接至少两种类型的所述靶核酸；并扩增连接产物。

所述方法包括提供包含多种类型的靶核酸的样品。样品可以是包含靶核酸的任何样品。例如，样品可以包括包含靶核酸的生物样品或化学样品。源自活生物体的生物样品可以从活生物体直接分离，或者分离并进一步加工(例如通过使用纯化和扩增)。例如，经分离的活生物体包括选自下组的至少一种：血液、尿、唾液、淋巴、组织和细胞。另外，经进一步加工的样品可以是任何样品，包括血清、由活生物体分离的核酸、或扩增的核酸。化学样品可以包括化学合成的靶核酸。样品可以包括RNA或DNA。样品可以包括miRNA。术语“miRNA”可以是真核细胞中存在的短RNA。miRNA在细胞生理学中具有重要的功能，并且可以充当在基因表达的翻译后的控制物(controller)。可以通过使用TRizol/TRI试剂的方法分离miRNA。也可以通过使用已知的分离试剂盒例如mirVana分离试剂盒(Ambion)和RNeasy试剂盒(Qiagen)分离miRNA。