[发明专利]一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体及该双抗装载的CIK细胞

说明书

技术领域

本发明涉及一种双特异性抗体，具体讲，涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体及该双抗装载的CIK细胞。

背景技术

越来越多的证据表明肿瘤干细胞在肿瘤免疫逃逸、抵抗放、化疗和复发转移中起到了至关重要作用，因此治疗肿瘤需要创建有效靶向杀灭肿瘤干细胞的新策略才有可能根治肿瘤，靶向肿瘤干细胞的免疫治疗在单克隆抗体和干细胞疫苗研究方面已经开展了积极的探索。到目前为止，所发现的肿瘤干细胞特异性标志物非常稀少，而CD133则是目前所发现肿瘤干细胞中最常见的标志物之一，在脑瘤、白血病、黑色素瘤、肾癌、大肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌等多种肿瘤干细胞中存在，它的高表达与肿瘤病人的低生存率密切相关。

由此本发明选择CD133作为针对CD133阳性肿瘤干细胞治疗研究的新靶点，构建了靶向CD133靶点的抗CD3/抗CD133双特异性抗体。

过继免疫治疗中，CIK作为新一代细胞所兼具的T淋巴细胞强大的杀瘤活性与NK细胞非MHC限制性杀瘤特征,在临床取得了很大的进展，但是治疗效果仍然有限，其原因是CIK细胞缺乏特异性靶向杀伤作用。本发明构建了抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞。

发明内容

本发明的首要目的在于提出一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体；

本发明的第二发明目的在于提出装备有该双抗的CIK细胞。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体含有抗CD3的单克隆抗体和抗CD133的单克隆抗体。

本发明中抗CD3/抗CD133双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）将抗CD3的单克隆抗体溶解于Traut's试剂，15～25℃下作用1～2小时；用PD-10柱过滤，除去未交联的单克隆抗体；

（2）CD133/1单克隆抗体溶于交联剂Sulfo-SMCC，15～25℃下作用1～2小时；用PD-10柱过滤，除去未交联的单克隆抗体；

（3）将步骤（1）步骤（2）得到的交联后的单克隆抗体混合，1～4℃下作用12～18小时。

本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞。

该抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）CIK细胞的培养：

取健康外周静脉血10ml，肝素抗凝，用生理盐水1：1稀释后，加至淋巴细胞分离液上层，离心收集单个核细胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×10⁶个/ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养12～24h，然后加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb50ng/ml，rhIL-21000U/ml，每两天添加rhIL-21000U/ml，在培养第14天，检查CD3、CD4、CD8和CD56收获CIK细胞；

（2）CIK细胞表型的检测：

调整培养0天和14天的CIK细胞浓度为5×10⁶个/ml，各取200μl加入离心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四标抗体及同型对照IgG1单抗各5μl，混匀，在4℃暗室反应20～40min后，PBS洗涤1～3次，流式细胞仪检测CIK细胞中CD3阳性细胞≥85%，CD3和CD8双阳性细胞≥60%，CD3和CD56双阳性细胞≥20%；

（3）抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载CIK细胞：

离心收集培养14天并经表型检测的CIK细胞，PBS洗涤1～3次，按1×10⁶CIK/50ng双抗浓度加入抗CD3/抗CD133双特异性抗体，混匀后室温静置40～80分钟，PBS洗涤1～3次。

下面对本发明的内容做进一步的解释和说明：