[发明专利]氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶学技术，具体是以氧化双醛纤维素为载体固定化脲酶的制备方法。

背景技术

脲酶在污水处理、酿酒以及医疗领域都具有很高的潜在价值。但是由于脲酶价格昂贵，溶液中的脲酶容易变性失活，反应后的脲酶难以回收，无法重复利用，极大地限制了脲酶的应用。为了提高脲酶在溶液中的稳定性，重复使用性和贮存稳定性，采用适当的方法将脲酶与载体键联连接固定从而克服游离态脲酶的缺点，是一种可行的技术途径。

目前脲酶的固定化载体材料选择比较广泛，主要分为无机材料和有机材料，其中有机材料包括聚合物(如改性聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇)、藻朊酸盐和壳聚糖及其衍生物。纤维素、壳聚糖、淀粉等天然多糖类载体在自然界中大量存在，容易获得，价格便宜，载体性能比较稳定，被广泛应用于生活中的各个领域。但是由于此类载体缺少能与酶结合的功能基团，只能以吸附方法将酶固定在载体上，得到的固定化脲酶重复使用性能比较弱。

本发明以纤维素为原料，经化学改性，制备的氧化双醛纤维素具有良好的生物相容性、生物可降解性、环境友好和无毒等特点，并具有纤维素不具有的活性功能基团，反应活性更强，是一种优良的载体材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：

本氧化双醛纤维素固定化脲酶的制备方法是按如下步骤进行：

一、氧化双醛纤维素的制备：

(1)纤维素的活化：将微晶纤维素或棉纤维置于质量比为12％-20％的NaOH水溶液中润涨24h，用蒸馏水洗至中性，抽滤后将得到的固体置于30-40℃烘箱中干燥3h，研磨成粉末备用；

(2)纤维素的氧化：将活化后的微晶纤维素或棉纤维与1∶1-1∶4的重量比的高碘酸或高碘酸钠置于水热合成反应釜中，加入蒸馏水，填充系数为0.6-0.9，将此密闭的水热合成反应釜置于110-130℃烘箱中反应4-10h；反应结束后，滤纸过滤得到固体，并用蒸馏水反复冲洗该固体4-5次，抽滤后将固体置于30-40℃烘箱干燥3h后研磨成粉备用；将干燥得到的产物再进行一次相同方法的选择性氧化反应，即得氧化双醛纤维素，再将氧化双醛纤维素置于30-40℃烘箱中干燥3h后放入4℃冰箱中保存；

二、固定化脲酶的制备：

(1)分散相的制备：取步骤一(2)得到的氧化双醛纤维素载体，加入pH4-10的磷酸盐缓冲液制备分散相；控制氧化双醛纤维素在此分散相中的质量比为3％-5％；

(2)脲酶的固定：向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液浓度为0.1-20mg/mL，控制反应温度2-8℃，磁力搅拌2-4h；

(3)洗涤干燥：用纱布过滤得到固体，将此固体用去离子水洗涤4-5次，除去未固定的游离脲酶，真空冷冻干燥得到固定化的脲酶。

本发明的有益效果是：本发明采用水热合成反应、利用密闭的压力容器，以水为溶剂，氧化反应更充分，比传统的方法获得的氧化纤维素，其醛基含量较高，能为脲酶与载体的连接提供更多的活性结合位点。本方法的载体性能稳定、酶固定化的条件温和，方法简便。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步详述：

脲酶是一种专一分解尿素的酶类，又名酰胺水解酶。在水存在的条件下，将尿素分解为氨和二氧化碳，是一般尿素分解反应(无脲酶催化)速度的10¹⁴倍。因此脲酶在污水处理、酿酒以及医疗领域都具有很高的潜在价值。但是由于脲酶价格昂贵，溶液中的脲酶容易变性失活，反应后的脲酶难以回收，无法重复利用，极大的限制了脲酶的应用。为了提高脲酶在溶液中的稳定性，重复使用性和贮存稳定性，可采用适当的方法将脲酶与合适的载体键联连接固定从而很好的克服游离脲酶的缺点。脲酶的固定化载体材料选择比较广泛，纤维素、壳聚糖、淀粉等天然多糖类载体；聚乙烯，聚丙烯腈等聚合物载体；以及蚕丝素蛋白、磁性微球等其他新型载体均可作为脲酶的固载材料。优良的固定化载体材料应有化学性质稳定、亲水性、具有一定刚性、机械稳定性、较大的表面积及抗微生物浸染等特点。