[发明专利]HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗MAGE抗原特异性CTL的制备方法。

背景技术

一、肿瘤治疗的困境与机会

恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。

二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展

上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注（3×10^10-11），另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2（IL-2）（10万IU/kg，q8h），因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ（IFN-γ）、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse anti-Human CD3mAb）共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。

树突状细胞（DCs）是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞（APC），其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子（MHC I类和MHCⅡ类分子），免疫共刺激分子（CD80、CD83、CD86、CD40等）。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8（IL-8）、干扰素α（IFN-α）、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等，增强机体非特异性免疫应答（天然免疫），故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。

三、MAGE基因在肿瘤免疫治疗中的作用

黑色素瘤相关抗原基因（Melanoma antigen-encoding Genes,MAGEs）包括MAGE-A，-B和-C家族，它们表达于各种类型的肿瘤组织中，包括黑色素瘤、食管癌、肝癌、多发性骨髓瘤、子宫癌、口腔鳞癌等等，而不表达于正常组织，除了睾丸生殖细胞，编码一系列能够被CTLs识别的抗原。目前人类已发现有MAGE基因编码的、能够被CTL特异性识别的抗原肽包括有MAGE-A1编码，HLA-A1递呈的9肽EADPTGHSY，MAGE-A2编码，HLA-A0201递呈的9肽KMVELVHFL，MAGE-A3编码，HLA-A24递呈的9肽IMPKAGLLI，MAGE-A4编码，HLA-A2递呈的10肽GVYDGREHTV等等。由于MAGE基因在肿瘤中的特异性表达以及它们能够引起特异性的CTL的肿瘤杀伤作用，使得MAGE基因编码的抗原成为肿瘤治疗的靶抗原。研究人员通过先前的临床试验已经证实MAGE-A3多肽能够诱导免疫应答，在28-55%的患有转移性黑色素瘤的患者中引起了肿瘤的消退。Bricard等发现MAGE-A10特异性的CTL在肿瘤损害部位密集，而在正常肝组织中不存在，同时，CTL在体外具有强大的杀伤肿瘤细胞的能力，因此对肝癌具有抗肿瘤作用，从而使通过应用MAGE-A10对肝癌进行免疫治疗成为可能。

四、CTL作用机理