[发明专利]猪脂肪组织特异性表达基因plin启动子及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪中脂肪组织特异性表达基因plin的不同长度启动子区域的分离鉴定及功能验证。

背景技术

高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，可与众多的转录因子相互作用调控基因的表达(武力，1999)。因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等有利于我们更好的理解相应基因的功能及基因间的互作关系。

根据启动子作用方式及功能的不同可将启动子分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子是指在该类启动子的调控下，基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平没有明显差异。诱导型启动子是指在某些特定物理或化学信号的刺激下，该种类型启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。组织特异性启动子是指在该类启动子的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特征。

外源基因在机体中能否高效稳定地表达是基因工程研究的关键。在真核细胞中利用基因工程技术构建多种真核表达系统进行外源基因的表达已经是一项常用的技术，但是经常面临的问题是外源基因的表达量较低，且表达往往存在于机体的几乎所有组织中，如现阶段广泛利用的CMV及SV40启动子。两者均可以携带外源基因与几乎所有类型的细胞中高效地表达。这两种高效的启动子存在的问题是显而易见的：不具备调控基因靶向表达于某一特定组织的能力。能够解决此问题的关键乃是具备较高活性的组织特异性启动子的获得。组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病的治疗方面的前景尤其可观。鉴于组织特异性启动具备这样的特质，在基因工程中越来越获得研究者的青睐。

组织特异性的启动子在动物机体中能够启动外源基因在特定的部位表达，保持特异性，这不仅克服了组成型启动子因外源基因过度广泛的表达而造成过度的浪费的缺点，并且能够促使外源基因在某些特定的部位高效且特异性表达，具有明显的时空特异性。

到目前为止对于组织特异性启动子的研究也有了一些成果，最早开始是在植物方面的一些研究，从植物中成功分离了一些组织特异性启动子，如：Sunikumar等人分离并且获得了棉花α球蛋白B基因启动子，将其同gus报告基因连接后，分别依次导入棉花、烟草和以及拟南芥中，经研究发现，报告基因仅表达于种子中，具有高度的组织特异性；（刘京鸽，2010）；在植物方面组织特异性启动子的分离以后在植物的抗虫、抗病、培育优良品种方面将会得到广泛的应用。在动物方面的研究相对植物就滞后一点，但是还是有一定成效的，大部分还是出于对一些疾病的治疗。

在获得的这些组织特异性启动子的同时也存在一些问题，如：特异性并不是很高；分离并且获得应用的特异性启动子并不是很多，限制了在基因工程中的应用；分离出来的启动子活性很低等问题。我们想要提高组织特异性启动子活性可以从以下几个方面：（1）构建双启动子：有研究者构建了小鼠的SP启动子的基础上又加了CMV强启动子，将重新构建好的启动子称双启动子，结果发现通过构建双启动子的方法可以提高外源基因在C2C12细胞中的表达水平（章倩倩，2007）。（2）构建嵌合启动子：即将对同一组织有特异性的两个或两个以上不同的启动子或调控元件组合在一起。最常用的方法是不断地筛选多种组合的组织特异性元件，最后选出最理想的组合来使用。小鼠的骨骼肌α-肌动蛋白基因启动子，TEF-1、MEF-1、MEF-2寡核苷酸随机组合筛选出的活性最强的嵌合启动子SP启动子，可以将携带外源基因在骨骼肌中高效并且稳定的表达。

脂肪细胞脂解的过程是体内能量代谢的主要核心反应，即脂肪酶将甘油三酯水解的过程。脂滴核心为中性脂质，即胆固醇酯或甘油三酯等，外周围被单层的磷脂分子包被着，其中单层的磷脂中存在着一些与脂滴相关的蛋白，这些蛋白的存在对脂滴的代谢过程及其脂滴的调节过程起到举足轻重的作用(Greenberg A,et al.,1991)。有研究结果表明，在脂肪水解过程中脂酶会发生位置的变化，将从细胞液中转移到脂滴的表面，在整个脂解反应过程中脂滴表面所存在的脂滴包被蛋白起到了至关重要作用（赵小玲，朱庆脂，2006）。