[发明专利]产低温乳糖酶的拉恩氏菌筛选及培养方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种从新疆天山冻土中分离得到的拉恩氏菌R3(Rahnella sp.R3)；本发明涉及该拉恩氏菌R3(Rahnella sp.R3)的筛选及培养方法。 

背景技术

乳糖酶(β-D-半乳糖苷水解酶，EC3.2.1.23)，可来源于植物、动物和微生物，能够催化乳糖中β-半乳糖苷键水解为葡萄糖和半乳糖。乳糖是牛乳中最主要的碳水化合物，含量约为4.5％～5.0％。某些人群不能吸收利用乳糖，会引发乳糖不耐症。目前，解决乳糖不耐症的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖来生产低乳糖或者无乳糖乳制品。现在商业化的乳糖酶大多是常温型的，酶的最适反应温度是37℃或者更高，在低温下催化活性很低。由于乳品加工大部分操作都是在低温(4℃左右)进行，因此在乳品加工采用常温型或耐热型乳糖酶水解乳糖并不合适，而低温乳糖酶在低温有较高活性，能在低温下有效水解牛乳中的乳糖，因此具有很好的应用前景。目前国内外报道分离筛选的产低温乳糖酶菌株主要来自于极地和深海，多数为细菌，少数为酵母。 

天山冻土属我国高海拔高山常年冻土类型，在这种冻土环境中微生物产生了一系列适应低温、寡营养、强辐射、冻融等极端因子的分子机制，为冻土微生物生理生化多样性提供了可能。 

发明内容

本发明的目的是筛选产低温乳糖酶且酶活较高的菌株，经鉴定，分类命名为拉恩氏菌R3(Rahnella sp.R3)，于2012年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，，保藏编号CCTCC NO：M 2012250，采用单因素实验及正交实验的方法进行该菌株的发酵条件优化，获得最优的培养基及培养条件。 

1.筛选方法 

(1)初筛：吸取富集后的培养液用倍比稀释法制不同的稀释度移入初筛平板中，涂匀，15℃培养，筛选蓝色菌落，分离纯化，斜面保存。 

(2)复筛：选取上限温度为40℃，即在该温度不生长的菌株为低温菌，选取此菌为试验菌株。活化斜面保藏试验菌株，转接发酵培养基于15℃进行摇瓶培养(50mL/250mL)48h。提取粗酶液，测定15℃下水解活力，选取活性较高菌R3为试验菌株。 

2.发酵条件优化： 

(1)培养基组成对菌体产酶的影响 

选取蛋白胨、酵母浸膏、乳糖、氯化钠4个因子，采用4因素3水平的正交表L₁₆(3⁴)设计实验，考察不同培养基对菌体产酶的影响。 

根据极差分析(见表1)，产酶影响因子排序为乳糖＞蛋白胨＞氯化钠＞酵母膏，最优组合为A₃B₃C₃D₁。按照最优组合的培养基进行实验，测得发酵液酶活为5.84U/mL，高于表中的任一值。 

表1发酵培养基组成正交试验设计与结果 

(2)摇瓶条件对菌体产酶的影响 

选取装液量、接种量、起始pH、种龄4个因子，采用4因素3水平的正交表L₁₆(3⁴)设计实验，考察不同摇瓶条件对菌体产酶的影响。 

根据极差分析(见表2)，产酶影响因子顺序为种龄＞起始pH＞接种量＞装液量，最优组合为A₃B₂C₂D₂。按照最优组合的摇瓶发酵条件进行产酶实验，测得发酵酶活为5.92U/mL，高于表中的任一值。 

表2发酵条件的正交试验设计与结果 

3.Rahnella sp.R3发酵条件优化结果 

根据正交结果，我们设定最佳发酵工艺：乳糖5％，蛋白胨1.5％，酵母浸膏1.0％，氯化钠0.3％，装液量为250mL三角瓶装50mL，培养基初始pH 7.0±0.2。4％接种量，15℃，200r.min^-1发酵32h测得发酵液酶活为5.92U/mL 。 

具体实施例

实施例一：产低温乳糖酶的拉恩氏菌R3(Rahnella sp.R3)筛选方法 

(1)初筛：吸取富集后的培养液用倍比稀释法制不同的稀释度移入初筛平板中，涂匀，15℃培养，筛选蓝色菌落，分离纯化，斜面保存。