[发明专利]一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于超分辨显微领域，特别涉及一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置。

背景技术

共焦显微镜最早是由M.Minsky于1957年提出，最初目的是为了消除普通光学显微镜在探测样品时产生的散射光影响。之后，共焦显微术因其出色的三维层析能力和高分辨率等特点迅速得到推广。然而，尽管共焦显微镜使其横向分辨率提高到相同孔焦比的普通光学显微镜的1.4倍，但与其轴向分辨率相比仍差两个数量级，横向分辨率和轴向分辨率之间存在着极大的不平衡，因此进一步改善共焦显微系统的成像分辨率特别是横向分辨率变得尤为迫切。

起初，人们通过增大物镜数值孔径NA和减小光波波长等方法来改善共焦系统的成像分辨能力，但是很快发现了这类方法的局限性，光学衍射极限制约了共焦显微系统成像分辨率的进一步提高。超分辨思想最先于1952年由Francia提出，但是直到共焦显微技术的出现和针孔的使用才使光学超分辨真正具有了实际意义。为了打破光学衍射极限的限制，从根本上改善共焦显微镜的成像分辨率，人们尝试了许多方法，例如4PI共焦显微镜、共焦干涉显微镜、基于非线性效应的双光子或多光子显微镜和基于针孔差分的差动共焦显微镜等方法。

国内学者针对基于针孔差分的差动共焦显微镜也做了比较深入的研究，例如，赵维谦等人提出了具有高空间分辨力的差动共焦扫描检测方法，并申请了相关专利(申请专利号CN200410006359.6)。但是基于针孔的超分辨方法并不仅仅局限于上述专利中的方法，本发明提出一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置，与上述专利中通过移动针孔进行差分的差动共焦显微术不同，本发明通过对两个在不同大小针孔的滤波作用下的共焦信号进行分析和处理，横向分辨率得到显著改善，实现了横向超分辨。

发明内容

本发明提供了一种基于双针孔的超分辨显微方法和装置，装置结构简单，易于操作，共焦显微系统的横向分辨率显著改善，实现了横向超分辨，可用于光学显微领域以及纳米高精度检测、测试和制造等领域。

一种基于双针孔的超分辨显微方法，包括激光器发射出的光束聚焦到样品的表面形成信号光，将该信号光分为强度相等的两束光，这两束光分别通过第一针孔和第二针孔后进入相应探测器并进行对应的处理，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑。

针对非荧光样品，信号光为光束聚焦到样品表面产生的反射光和散射光，针对荧光样品，信号光为光束聚焦到样品表面激发的荧光。

优选的，所述第一针孔面积为1.5个爱里斑，所述第二针孔面积为4.5个爱里斑。

所述第一针孔面积选择1.5个爱里斑的原因是为了与聚焦到样品表面的光斑大小匹配从而构成标准的共聚焦系统，所述第二针孔的面积选择4.5个爱里斑的原因是为了与所述第一针孔的1.5个爱里斑的大小匹配以获得最好的处理结果。

优选的，所述第二针孔为环形孔，所述环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，所述环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑。

第二针孔可替换为环形孔，环形孔的中心不透光面积在0.5～2个爱里斑之间，环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和在2～5个爱里斑之间，环形孔所在平面与于第二针孔所在平面重合，环形孔中心与于第二针孔中心重合。

针对非荧光样品，本发明提供了一种基于双针孔的超分辨显微装置，包括用于发出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的偏振片、偏振分束器、四分之一波片、第一透镜和用于承载待测样品的纳米平移台，依次布置在所述偏振分束器的反射光路上的第二透镜和分束器，分别用于对所述分束器射出的第一测量光和第二测量光进行滤波的第一针孔和第二针孔，以及收集通过所述第一针孔和第二针孔的光强信号的探测系统，所述第一针孔面积为0.5～2个爱里斑，所述第二针孔面积为2～5个爱里斑。

探测系统由第一探测光纤、第一探测器、第二探测光纤、第二探测器和计算机组成。其中，第一探测光纤和第二探测光纤参数和性能完全相同，且两光纤端面面积足够收集通过两针孔的全部光强。

优选的，所述第一针孔面积为1.5个爱里斑，所述第二针孔面积为4.5个爱里斑。

所述第一针孔面积选择1.5个爱里斑的原因是为了与聚焦到样品表面的光斑大小匹配从而构成标准的共聚焦系统，所述第二针孔的面积选择4.5个爱里斑的原因是为了与所述第一针孔的1.5个爱里斑的大小匹配以获得最好的处理结果。

优选的，所述第二针孔为环形孔，所述环形孔的中心不透光面积为1.5个爱里斑，所述环形孔的透光部分与中心不透光部分面积之和为4.5个爱里斑。