[发明专利]产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体地，涉及一种产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法。

背景技术

慢性淋巴细胞白血病是一种相对少见的恶性肿瘤，大约占所有癌症的0.8%，它是一种影响B淋巴细胞系的恶性肿瘤，其特点是产生大量不成熟的淋巴细胞，这些细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。慢性淋巴细胞白血病是一种进展缓慢、惰性的肿瘤，患者通常保持无症状达数月至数年。发病原因仍未明确。慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病可以发生于任何年龄的人群，但以60岁以上的人群最常见，男性比女性更常见。

因为慢性淋巴细胞白血病进展比较缓慢，所以很多病人没有症状，尤其在早期的病人，随着疾病的进展，白血病破坏骨髓正常造血功能，浸润器官，引起了明显但非特异的症状。包含有：贫血，表现为乏力、头晕、面色苍白或活动后气促等；反复感染且不易治好，主要由于缺少正常的白细胞，尤其是中性粒细胞；出血倾向：容易出血、出血不止、牙龈出血、大便出血及月经不规则出血等，由于血小板减少引起；浅表淋巴结肿大 、不明原因的消瘦及盗汗等。

慢性淋巴细胞白血病是一种惰性的淋巴系统肿瘤，患者可以维持无症状长约数月至数年，不需要治疗。但对于某些出现症状等需要治疗，为了进一步研究可以用于治疗或预防或抑制慢性淋巴细胞白血病药物，在研发过程中进行药物试验、药效试验时，均需要大量的慢性淋巴细胞白血病细胞作为标本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法，包括下述步骤：

1）准备受过辐射的巨噬细胞分散在细胞培养器中； 

2）从慢性淋巴细胞白血病病人的血样中分离出外周血液单核细胞，将分离的外周血单个核细胞置于完全培养基中冲洗，冲洗后置于离心管中以1500RPM离心3分钟；

3）将离心后的外周血单个核细胞重新分散于完全培养基中形成2*10⁶个外周血单个核细胞/ml的完全培养基，该完全培养基包含50μg/ml的胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸和5μg/ml环孢菌素A；

4）向步骤3）的完全培养基中添加疱疹病毒悬浮液；

5）在含5%二氧化碳的恒温箱中，37℃下培养细胞4小时；

6）保温后，将疱疹病毒感染后的细胞以3500-4000个细胞/ml重新分散在包含有18μg/ml胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸的完全培养基中，然后分散于包含受过辐射的巨噬细胞的细胞培养器中；

7）在含5%二氧化碳的恒温箱中，37℃下培养细胞；

8）每周一次，从每格中取出100μl培养基，再添加100μl包含5μg/ml胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸的新鲜培养基；

9）在感染后2-4周，用ELISA收集细胞培养器中的抗体产品，然后用杂交瘤细胞融合法产生并克隆出源于慢性淋巴细胞白血病细胞的杂交瘤细胞株。

具体地，所述步骤1）中的巨噬细胞为J774A.1细胞。

所述步骤1）中受过辐射的辐射剂量为4200rad。

所述步骤9）中杂交瘤细胞融合法的具体步骤为：在感染后2-4周后，对HIV-1、丙型肝炎病毒和流感病毒结合和中和活性筛选抗体，选择呈阳性的细胞培养器中的细胞与杂交瘤细胞株融合，经有限稀释后获得杂交瘤细胞株。

本发明的有益效果是：本发明提供一种产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法，该方法可以获得大量的慢性淋巴细胞白血病细胞作为研究标本，在研究用于治疗或预防或抑制慢性淋巴细胞白血病药物时用于药物试验或药效试验。并且，可以通过研究获得的杂交瘤细胞株研究或者提纯抗体，可以对于制备防治慢性淋巴细胞白血病细胞的药物或者抗体或者生物片段作出进一步研究。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不仅限于下述实施例。

本实施例适用于产生无限克隆的B慢性淋巴细胞白血病细胞的方法具体步骤为：     

1、在疱疹病毒感染的24h前，准备受过辐射（辐射剂量为4200rad）的巨噬细胞（本实施例选用的巨噬细胞为J774A.1细胞）分散在细胞培养器中，培养器为圆底薄板，受过辐射的巨噬细胞并以50000细胞每格（100ug/格）分散在96格薄板上。