[发明专利]一种胶原基骨软骨三层复合物及其制备方法

权利要求书

1.一种胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于所述复合物按如下方法制备：（1）在模具中注入胶原-磷酸盐混合溶液，-20~-80℃冷冻4~24h，再注入5~20mg/mL胶原水溶液，0~8℃条件下静置1~15min后于-20~-80℃冷冻4~24h，最后注入35~45mg/mL的胶原水溶液，0~8℃条件下中静置1~15min后于-20~-80℃冷冻4~24h，去除模具，获得致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物；所述胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原-磷酸盐混合溶液是将可溶性磷酸盐与10~60mg/mL胶原水溶液混合配制而成，所述可溶性磷酸盐与10~60mg/mL胶原水溶液中胶原的质量比为1~3:1；所述胶原-磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液与35~45mg/mL的胶原水溶液的注入体积比为2~6:2~5:1；（2）将步骤（1）获得的致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物迅速放入-20~0℃预冷2~24h的无水乙醇a中，0~10℃浸没反应2~10min，去除无水乙醇a后迅速放入-20~0℃预冷2~24h的0.05~0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液中，0~40℃浸没反应12~48h，去除反应液，获得致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物；（3）在4~28℃、20~40rpm条件下将步骤（2）获得的致密胶原-多孔胶原-胶原纳米羟基磷灰石复合物在无水乙醇b中浸没2~48h，去除无水乙醇b后加入EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液，在4~28℃、20~40rpm条件下浸没2~8h进行交联，交联结束后去除EDC-NHS的MES溶液，再用pH为7.4~9.0的缓冲液于4~28℃条件下浸没处理12~48h，去除缓冲液后水洗，冷冻干燥，获得所述胶原基骨软骨三层复合物；所述EDC-NHS的MES溶液为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺以4：1的质量比溶于浓度为10~50g/L，pH=5~7.5的2-吗啉乙磺酸的水溶液制备的蛋白交联剂溶液，所述蛋白交联剂溶液中EDC的终浓度为4mg/mL。

2.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（1）所述可溶性磷酸盐为磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸一氢钾或磷酸二氢钾中的一种或两种以任意比例的混合。

3.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（1）所述在模具中所注入的胶原-磷酸盐混合液、5~20mg/mL的胶原水溶液与35~45mg/mL的胶原水溶液的体积比为：3~5：2~4：1。

4.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（1）所述模具为聚四氟乙烯模具。

5.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（2）所述无水乙醇a的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10~20倍。

6.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（2）所述0.05~0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液的体积用量是致密胶原-多孔胶原-胶原水溶性磷酸盐复合物体积的10~20倍。

7.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（2）所述钙盐的无水乙醇溶液为氯化钙或硝酸钙溶于无水乙醇中制成0.05~0.5mol/L钙盐的无水乙醇溶液。

8.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（3）所述EDC终浓度为4mg/mL的EDC-NHS的MES溶液的体积用量以胶原-磷酸盐混合溶液、5~20mg/mL胶原水溶液、35~45mg/mL的胶原水溶液中胶原的总质量计为0.1~0.3mL/mg。

9.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：步骤（3）所述缓冲液为pH值7.4~9.0的Tris-base缓冲液。

10.如权利要求1所述胶原基骨软骨三层复合物，其特征在于：胶原-磷酸盐混合溶液、10~20mg/mL胶原水溶液、35~45mg/mL的胶原水溶液中胶原为水溶性Ⅰ型胶原，所述胶原按如下步骤制备：①取二月龄健康白猪的新鲜猪腿，剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪成肌腱薄片，浸泡于体积浓度75%的乙醇水溶液中，4℃过夜；②将步骤①的肌腱薄片用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，调节pH至1，加入胃蛋白酶，4℃放置3天，获得胶原溶胶液；所述乙酸水溶液的体积用量以肌腱薄片质量计为18.9mL/g，所述胃蛋白酶质量用量以肌腱薄片质量计为94.7mg/g；③将步骤②获得的胶原溶胶液于4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1：10混合，间歇震荡，4℃过夜，再在4℃、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b；④按下述方式之一处理，制备水溶性Ⅰ型胶原：a、将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4℃溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4：1，获得所述水溶性Ⅰ型胶原；b、将沉淀b置于直径0.25μm的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水4~6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80℃过夜，再于冻干机中抽干2~3天，获得所述水溶性Ⅰ型胶原。