[发明专利]山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，属于细胞生物学与生物技术领域。 

二、技术背景

真皮成纤维细胞（Dermal fibroblast,DFB）是构成皮肤真皮组织的主要细胞，其正常的增殖分化对于皮肤生理机能调控、伤口愈合及组织工程皮肤重建等方面均发挥着重要作用。在皮肤组织中，真皮成纤维细胞能够分泌表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-β（TGF-β）等多种生长因子，他们作用于表皮细胞、血管内皮细胞以及毛囊相关细胞，可诱导表皮形成，加速血管生长，调控毛囊生成与周期性再生。此外，真皮成纤维细胞还能够为其它细胞提供胶原蛋白、弹性蛋白等多种细胞外基质。这些细胞外基质作为真皮结构的重要组成部分，对皮肤正常结构维持、其它皮肤细胞的粘附以及毛囊等皮肤附属器官形态保持均具有重要作用。近年来研究发现，体外培养的真皮成纤维细胞中可分离得到真皮干细胞，该干细胞可在特定诱导条件下分化生成脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞、黑素细胞以及毛乳头细胞等多种其它组织细胞。同时，DFB因具有易于培养、增殖快速、形态和生物学特性相对稳定等特点，可为遗传资源保护、基因组文库构建、体细胞克隆、基因遗传多样性研究等领域提供理想的生物学材料。 

常用的真皮成纤维细胞原代培养方法主要分为两类：单纯机械解离法与酶消化解离法（Christiano AM.et al.,2004;Schlabe J.et al.,2008）。单纯机械解离法是将皮肤真皮组织切割成小块（1mm²），经PBS润洗后，贴附于培养瓶或培养板中，待贴附牢固后加入含血清培养液，置于37℃、5％CO₂条件下进行原代培养。该方法操作简单，适用于从少量皮肤组织中分离细胞（Almqvist S.et al.,2009;XiangY.et al.,2011）。酶消化解离法是将真皮组织制成组织悬液，然后浸入温胰蛋白酶中进行消化处理。每隔半小时收集细胞一次，使用含血清培养液重悬细胞后，接种于培养瓶或培养板中启动原代培养（Park JK.,2007）。以上两种方法虽然均能获得真皮成纤维细胞，但仍存在组织块贴附不牢、细胞因酶消化而损伤等不足，且经多次传代后较多细胞出现异常二倍体核型，以致丧失其生物学特性。 

上述真皮成纤维细胞的培养多以人的皮肤为细胞的组织来源。对于其它哺乳动物DFB的培养，上述培养方法与分离技术亦同样适用。研究表明，将小鼠、牛、猪、兔等多种动物的真皮组织小块贴附与培养器皿上，加入含FBS的商品化培养液（MEM系列、DMEM系列、RPMI-1640系列、F10和F12系列等），静置培养10~15天，便可获得较多量的DFB（Dame MK.et al.,2008;梅志强等，2007；马红等，2009）。另有学者应用改进的酶消化解离方法，成功分离培养了大鼠、牛、猪、兔等家畜以及大熊猫等濒危动物的成纤维细胞，并建立相应细胞系与细胞株（Ikumi S.et al.,2004;TaoY.et al.,2009;Li LF.et al.,2009;GuanWJ.et al.,2010;Liu CQ.et al.,2011;陈大元等，1999；朱庆等，2005）。尽管许多学者在动物真皮成纤维细胞培养方面进行了大量的研究，但有关山羊真皮成纤维细胞体外培养研究，尤其是山羊真皮成纤维细胞系（株）建立等方面的报道相对较少。 

三、发明内容

技术问题 

为进一步开展真表皮细胞互作、皮肤附属结构发育与分化、动物毛绒产品质量提升等研究建立离体细胞模型，并为人类创伤愈合、皮肤移植与重建等提供重要参考，本发明提供了一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法。本发明的目的是建立与完善山羊体外培养真皮成纤维细胞系（Dermal fibroblast cell line）的构建方法，不仅可为阐明相关激素、生长因子、紫外线等理化因素对皮肤及其附属器官生长分化的调节机制提供研究模型；为提高山羊毛皮产品产量和品质的育种改良奠定基础；还可为提高其它动物的毛皮品质、 数量和花纹品质乃至医学领域的人类创伤修复、组织工程皮肤研究等奠定基础。 

技术方案