[发明专利]山羊真皮成纤维细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种山羊真皮成纤维细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）活体采集1-3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的完好皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后放入无血清培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；

（2）将步骤1）中采集的皮肤组织样经70％酒精浸泡，剪除表面毛发后，D-Hank’s液冲洗干净，吸去D-Hank’s液，加入约10mL 0.25％中性蛋白酶，4℃消化过夜；分离皮肤表皮层与真皮层，将真皮组织剪成约1mm³的小块，采用原代外植与消化培养相结合的方法，将真皮组织小块进行胰蛋白酶消化处理后接种于6孔培养板中，干燥处理4h，待组织小块贴附牢固后，每孔加入3mL完全培养液，在37℃，5％CO₂浓度饱和湿度条件下启动原代培养；待5-6天外植块周围迁移出大量细胞后，更换为等量的维持培养液，在37℃，5％CO₂浓度饱和湿度培养箱中继续进行培养；待原代真皮成纤维细胞生长至汇合时，消化移入培养瓶中培养，按照每瓶10mL量加入完全培养液进行培养，3天后更换为等量维持培养液，此后2-3天更换一次维持培养液；所述的完全培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10％FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含有10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和5％FBS的MEM培养液；

（3）当步骤2）所得的原代细胞生长至会合状态后，PBS液冲洗细胞1次，加入约1mL浓度为0.25％的胰蛋白酶浸润细胞约5秒，弃去，再加入4mL浓度为0.25％的胰蛋白酶消化处理约5min；当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，加入6mL完全培养液洗净残余消化液，1000r/min下离心5min后收集细胞，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入完全培养液继续培养，3天后更换为等量维持培养液，此后每3天更换维持培养液1次；所述的PBS缓冲液由8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.56g/L Na₂HPO₄·H₂O和0.2g/L KH₂PO₄组成；所述的完全培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和10％FBS的DMEM/F12培养液；所述的维持培养液为含10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素钠、100μg/mL硫酸链霉素、8μg/mL Tylosin和5％FBS的MEM培养液；

（4）选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×10⁵个/mL的细胞密度接种于培养瓶；所述的冻存培养液为含10％DMSO和30％FBS的DMEM/F12培养液。