[发明专利]一种用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷Ⅵ代谢的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一类化合物的代谢研究方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI代谢的新方法。 

背景技术

糖苷类化合物常指苷元与糖结合成的苷类化合物，如皂苷、黄酮苷等，是重要的天然产物，广泛分布于植物中，具有重要的生物活性，如保护心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤活性、抗炎、抗氧化、保肝、补肾壮骨等活性，糖苷类化合物在体内通常经体内胃肠道菌群作用脱去糖基，转化成次糖苷甚至是苷元，提高活性同时提高生物利用度。 

药物代谢通常分为I相代谢(氧化、还原、水解等)和II相代谢(结合反应)，糖苷化合物的的主要代谢途径为脱糖基的水解反应，此类反应通常由胃肠道菌群介导。研究方法亦采用常见的药物代谢研究方法：体内实验法和体外实验法。体内实验法：动物给药后，在一定时间内将动物处死，取消化道各部分内容物进行分析，并检查血液、尿、粪便、胆汁，检测代谢物的结构变化，研究药物的代谢转化，并推断其在消化道内的代谢过程。体内代谢试验能客观的反应药物在体内的转化，但一般药物用量较大，不利于少量药物的快速代谢研究；有些体内成分含量低微，即使采用现代分析手段有时也难以满足体内复杂体系的检测需求，而加大药量或进一步富集、纯化样本等手段对结果的改善也是有限的；体内代谢劳动强度相对较大，常需多人合作完成。体外实验法：胃肠道菌群代谢粪便温孵法和离体消化道内容物温孵法是研究药物在消化道内脱糖基水解代谢的方法。许多中药成分是在消化道菌丛作用下代谢的，特别是肠道内细菌的苷键水解酶或人的粪便悬浮液与药物在厌氧条件下温孵，检查原型成分及其代谢物的种类和含量，是研究肠内菌对药物代谢的有效方法。体外实验法虽然较有效的模拟了药物在体内代谢的不同环节，有益于富增、制备代谢产物，但脱离了完整的代谢体系对药物的作用，难以体现在体代谢的综合结果；体外实验条件要求相对较高，需保证肠菌的活性，一般实验室难以进行。因此，建立一种既能体现在体代谢的综合效应，又能实现条件简单，低劳动强度，化合物用量少的高通量代谢研究方法具有重要意义。 

斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3～4cm，养殖成本仅为养小鼠的0.1％-1％。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100％，所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P.Goldsmith，Curr Opin Pharmacol，4，504-12(2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S.Sumanas and S.Lin， DDT：TARGETS，3，89-96(2004).]。如中国专利200810019040.5公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法；专利200780051025.2公开了一种通过干细胞营养进行的器官的形成和以及酒精损伤器官的再生方法，200310108710.8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病；我们在201010258459.3公开了利用斑马鱼研究丹参中丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I相代谢的新方法，发现丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I的羟基化和脱氢反应的I相代谢产物，此方法建立系根据斑马鱼具有药物代谢的细胞色素P450s相关酶系：目前已克隆到的斑马鱼P450s基因主要包括：Cyp1A、Cyp2K6、Cyp3a65和Cyp3C1、Cyp11a1、Cyp19、Cyp26A1、Cyp26B1和Cyp26D1几个家族的成员，它们与人类相应基因的同源性约为40％～73％[P.Collodi，C.L.Miranda，X.Zhao，D.R.Buhler，D.W.Barnes.Xenobiotica，24(6)，487-493(1994)]。近年研究表明，斑马鱼尚具有II相代谢酶[Y.Morcillo，G.Janer.S.C.M.O’Hara，D.R.Livingstone，C.Porte.Environmental Toxicology and Chemistry，23(4)，990-996(2004)；D.V.Almeida，B.F.Nornberg，L.A.Geracitano，D.M.Barros，J.M.Monserrat，L.F.Marins.Fish Physiol Biochem.36(3)：347-53(2010)]，我们在201210187191.8公开了利用斑马鱼研究黄酮化合物白杨素、5-羟基黄酮和7-羟基黄酮的II相代谢，发现它们的葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物的II相代谢产物；此外斑马鱼还具有肠道菌群[吕爱军，杨正行，刘欢，胡秀彩，张艳华，程超.中国农学通报，2010，26(24)：412-415]，这类菌群能否使糖苷类化合物发生与哺乳动物肠道菌群类似的脱糖基水解反应，国内在这方面的研究尚属空白。